血凝血凝抑制试验说明书
鸡新城疫血凝与血凝抑制实验
鸡新城疫血凝(ha)及血凝抑制(h1)试验
基本原理:
许多病毒表面具血凝素,具有凝集某些动物或人红细胞的特性,称为血凝现象,可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制,称为血凝抑制现象,利用这种特性可进行血清学试验,称为血凝抑制试验。器材及试剂:
待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液;
待检血清:抗鸡新城疫病病毒阳性血清;
生理盐水/pbs、1%鸡红细胞、96孔v形微量血凝板、加样器等。
实验步骤
pbs的配制:
1%鸡红细胞的配制:
(一)血凝试验(ha)取96孔板,按以下步骤操作:
1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul,第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照;
2、吸50ul病毒液于第一排第1孔,混匀后取50ul至第2孔,依次稀释至第12孔,弃去50ul,各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul,微型震荡器震荡2min混匀。
4、室温静置10-30分,观察结果(见下表)。
5、结果判定:红细胞对照组红细胞完全沉降,以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数,作为病毒的血凝价,即hi效价,用2n表示。
(二)四单位检测:
(三)血凝抑制试验(hi)
取一96孔板,按以下步骤操作:
1、4个单位抗原的制备:按ha试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。
2、待检血清的稀释:第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul,于第一排第1孔中加入50ul待检血清,反复吹吸3-5次混匀后,取50ul至第2孔混匀,吸取50ul至第3孔,依次稀释至第12孔,弃去50ul,经倍比稀释,血清的稀释倍数为21~212。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul,微量震荡器震荡2min混匀;
4、室温静置20min;
5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul,微量震荡器震荡2min混匀混匀。
6、室温静置10-30分,观察结果(见下表);
7、结果判定:第二排为抗原对照,红细胞应全部凝集,第三排为红细胞对照,红细胞应全部沉降。以待检血清能完全抑制病毒凝集红细胞的最高稀释倍数为血清的hai效价,用2n表示。通常能使4个凝集单位病毒凝集红细胞的作用完全被抑制的血清最高稀释倍数,称为抗体的血凝抑制价(hi效价)。只有阴性对照孔血清滴度不大于21g2,阳性对照孔血清误差不超过1个滴度,试验结果才有效。