西方蜜蜂AmOBP17基因的生物信息学和表达模式分析
聂红毅，郭永康，郑秋岚，曾何泉
（福建农林大学 动物科学学院/蜂学学院，福州 350002）
西方蜜蜂嗅觉系统是高度发达的感受系统，其灵敏的嗅觉与生命活动的各个方面息息相关，如：蜂王通过分泌蜂王信息素控制蜂群的发展，工蜂通过识别幼虫信息素产生哺育行为，因此西方蜜蜂嗅觉系统对蜂群的发展和幼虫成长具有重大意义［1，2］.西方蜜蜂嗅觉感受器是蜜蜂识别气味分子的基础，西方蜜蜂触角上分布着大量嗅觉感受器，是在化学通讯中感受气味或化学分子的主要感受器官［3］.西方蜜蜂嗅觉感受器位于淋巴液中，脂溶性的气味物质很难在没有载体的情况下，穿过亲水性血淋巴到达嗅觉感受器，需要借助一种特殊的蛋白才能实现气味物质与嗅觉神经树突膜上的气味受体结合，而气味结合蛋白（odorant-binding proteins，OBPs）就是负责执行这一重要功能的蛋白［4］.
OBPs 是一种小分子可溶性蛋白，其三级结构高度保守，由 8 个反向平行的 β 折叠和 1 个短的 α 螺旋组成，位于感觉神经元周围的液体中，通过将气味分子穿过淋巴液输送到气味受体蛋白（ORs），促进 嗅 觉 系 统 的 敏 感 性［2，5-10］.2006 年 ，Forêt 和Maleszka［11］在西方蜜蜂中鉴定出了 21 个 OBPs 基因，明显少于冈比亚按蚊（70 个）和黑腹果蝇（51个）中的OBPs 基因数目，它们利用实时荧光定量技术发现，在西方蜜蜂触角中只有9 个OBPs 基因表达 .Iovinella 等［12］人在 2011 年利用蛋白质组学方法，研究了西方成年蜜蜂上颚腺中的OBPs 的表达与级型和日龄相关，发现OBP13 主要在刚出房蜜蜂和处女蜂王中表达，而OBP21 在采集蜂中高量表达，同样也在交配的蜂王中普遍存在，而且OBP14在工蜂的腺体中也有产生.2019 年，Wu Fan 等［13］通过交叉培育实验发现OBP14 对哺育蜂产浆有较大的影响.
本课题组前期研究发现气味结合蛋白17（odorant binding protein 17，OBP17）基因在自然蜂群的哺育蜂触角和人工组建相同日龄蜂群的哺育蜂触角中都显著上调表达，表明西方蜜蜂体内的OBP17 不仅在嗅觉功能中发挥作用，而且其可能在西方蜜蜂哺育行为中也发挥着重要作用［14］.但是OBP17 影响西方蜜蜂哺育行为的机理，还尚未报道.本研究在西方蜜蜂不同发育时期的转录组测序的基础上，克隆西方蜜蜂OBP17 基因，利用生物信息学方法预测其蛋白结构、生化理化性质，进一步探究OBP17 基因在脑部、上颚腺和咽下腺中的表达量，期望为OBP17 基因在西方蜜蜂中的深入研究提供理论基础.
1.1 实验蜂群
本实验所用蜂群来自于福建农林大学动物科学学院（蜂学学院）蜜蜂分子育种实验室所饲养的“蜂强1 号”西方蜜蜂.
1.2 主要试剂
Trizol 试剂盒、Blunt Zero 载体、大肠杆菌感受态细胞、琼脂糖、TAE 缓冲液、DNA marker 2K、Gel stain 生物染色剂购自北京全式金生物技术有限公司，反转录试剂盒、PCR 试剂盒购自南京诺维赞生物科技有限公司，DNA 凝胶回收试剂盒购自Omega、LB 培养基购自上海生工生物工程股份有限公司.
1.3 AmOBP17基因的克隆
在蜂群巢门口，随机抓取成年工蜂5 只，立即置于研钵中，加入液氮充分研磨.利用Trizol 法提取其RNA，并通过NanoDrop2000 和1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和完整度.取1 μg RNA 按照反转录试剂盒说明书要求，合成cDNA 的第一链，用于后续克隆.利用Primer 6.0 软件设计AmOBP17 基因（登录号为 NM_001040207）的特异引物（F：GATGTAATTCAAGTGCATTCGAGTCTG；
R：GTTGTCGTATCCTGAATAATCCTCTTG）.以成年工蜂的cDNA 为模板，扩增该基因CDS 全长序列.PCR 反应条件如下：95 ℃预变性3 min；
95 ℃变性15 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 1 min，循环数 35；
72 ℃终延伸 5 min.取 1 μL AmOBP17 基因 PCR 产物 50 ng/μL 与 1 μL Blunt zero 载体混合，37 ℃连接5 min，然后加入 Ttans1-T1 感受态细胞 50 μL，按照说明书要求进行转化操作.最后挑取10 个菌斑进行菌液PCR，将扩增出与目的条带大小一致且亮度较亮的菌液送去上海生物工程股份有限公司进行测序.
1.4 生物信息学分析
在NCBI 网站下载西方蜜蜂AmOBP17 基因mRNA 序列和氨基酸序列.基于pI/Mw 在线工具，计算其分子量与等电点；
SignalP-5.0 预测蛋白的信号肽；
ProtScale 软件预测蛋白的疏水性/亲水性.分别利用NEPhos 2.0 和NetOGlyc 4.0 预测蛋白的N 磷酸化、O 糖基化位点 .利用 NCBI conserved domain search 在线预测结构域，基于PSORT II Prediction 进行亚细胞定位预测.
1.5 AmOBP17基因的时空表达谱
基于本课题组前期的西方蜜蜂不同发育时期（1 日龄胚胎、2 日龄胚胎、3 日龄胚胎、1 日龄幼虫、3日龄幼虫、5 日龄幼虫、7 日龄幼虫、1 日龄蛹、3 日龄蛹、5 日龄蛹、7 日龄蛹、9 日龄蛹、刚出房蜜蜂、10 日龄哺育蜂、21 日龄采集蜂）转录组测序（数据未公布）以及3 日龄工蜂、10 日龄哺育蜂、10 日龄采集蜂、21 日龄哺育蜂和21 日龄采集蜂的脑部、咽下腺（SUB7391751）和上颚腺（SUB8031156）的转录组数据［14-16］，利用NovoMagic 平台从各转录组数据中提取AmOBP17 基因在各个样本中的FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值，作为该基因在各个样本中的基因表达量，分析AmOBP17 基因的时空表达模式；
在脑部、上颚腺和咽下腺的数据分析中，校准后的Padj ＜0.05 作为基因差异显著的阈值.
2.1 AmOBP17的基因克隆
以西方蜜蜂成年工蜂的cDNA 为模板，PCR 扩增包含AmOBP17 基因CDS 全长片段.琼脂糖凝胶电泳结果显示，500 bp 附近检测到明显的单一条带如图 1 所示 .经测序验证，AmOBP17 基因 CDS 全长为408 bp，与NCBI 中该基因序列基本一致.
图1 AmOBP17基因CDS序列琼脂糖凝胶电泳图
2.2 AmOBP17蛋白的结构和理化特性预测
西方蜜蜂气味结合蛋白OBP17（odorant binding protein 17）（登录号：NM_001040207）mRNA 全长1179 bp，包含5 个外显子，编码序列为408 个核苷酸，有135 个氨基酸残基.该蛋白17-126 位包含一个信息素/普通气味结合蛋白的结构域，具有6个保守的半胱氨酸残基形成3 对二硫键，如图2 所示.等电点和分子量分别为4.54 和15031.43Da.PSORT II Prediction 亚细胞定位预测OBP17 蛋白主要在内质网表达.AmOBP17 蛋白在第18、66 存在潜在的苏氨酸N 磷酸化位点，在第126 位存在潜在的酪氨酸N 磷酸化位点，在第84 位存在潜在的O糖基化位点.
图2 AmOBP17的氨基酸序列
基于 SignalP-5.0 预测 OBP17 蛋白 1-16 位氨基酸序列存在1 个Sec/SPI 类型的信号肽，该信号肽的概率为0.9862；
第16 位和第17 位氨基酸之间存在切割位点，如图3 所示.
图3 AmOBP17蛋白的信号肽预测
利用ProtScale 软件的Kyte and Doolittle 算法对西方蜜蜂AmOBP17 蛋白进行亲水/疏水性分析.结果显示西方蜜蜂AmOBP17 中疏水性最强的是4-16 区域，具有较强的疏水性的是61-64 区域；
77-80区域的亲水性最强，其次52-55、95-97 区域具有较强的亲水性，可见西方蜜蜂AmOBP17 的疏水区域大于亲水区域，如图4 所示.
图4 西方蜜蜂AmOBP17氨基酸序列疏水性/亲水性的预测
2.3 系统进化树分析
使用MEGA6.0 软件邻位相连法进行500 次重复计算，构建系统进化树如图5 所示，通过系统进化树可以发现，同属于蜜蜂属的大蜜蜂（Apis dor-sata）与AmOBP17 的亲缘关系最近.
图5 AmOBP17基因系统进化树
2.4 AmOBP17基因的时期表达谱
转录组分析AmOBP17 基因在不同发育时期（1 日龄胚胎、2 日龄胚胎、3 日龄胚胎、1 日龄幼虫、3日龄幼虫、5 日龄幼虫、7 日龄幼虫、1 日龄蛹、3 日龄蛹、5 日龄蛹、7 日龄蛹、9 日龄蛹、刚出房蜜蜂、10 日龄哺育蜂、21 日龄采集蜂）的表达模式如图6 所示.结果表明：该基因从1 日龄胚胎至5 日龄蛹期表达量较弱（或基本不表达），刚出房蜜蜂和哺育蜂中表达量最高，其哺育蜂时期达到表达量的峰值，暗示该基因可能在刚出房蜜蜂和哺育蜂感知蜂群内信息素分子中发挥重要作用.
图6 AmOBP17基因时期表达谱检测
2.5 AmOBP17 基因在脑部、上颚腺和咽下腺中的表达量
通过 3 日龄工蜂、10 日龄采集蜂、10 日龄哺育蜂、21 日龄采集蜂和21 日龄哺育蜂的转录组分析，发现AmOBP17 基因的表达量在10 d 哺育蜂和21 d哺育蜂脑中的表达量显著高于相同日龄采集蜂脑中的表达量如图7（A）所示（P ＜ 0.05），其中10 日龄的哺育蜂和21 日龄哺育蜂脑部表达量较高，3 日龄工蜂脑部的表达量最低，且AmOBP17 基因的表达量在10 日龄和21 日龄采集蜂脑部表达量差异不显著（P ＞ 0.05）.通过5 个样本上颚腺的转录组分析，发现AmOBP17 基因在10 日龄哺育蜂上颚腺中的表达量显著高于3 日龄工蜂和21 日龄采集蜂中的表达量，在10 日龄哺育蜂上颚腺中的表达量也显著高于10 日龄采集蜂上颚腺中的表达量（P ＜0.05），该基因在21 日龄哺育蜂上颚腺中的表达量显著高于21 日龄采集蜂中的表达量（P ＜0.05）如图7（B）所示.同样地，通过分析5 个样本咽下腺的转录组数据，发现AmOBP17 基因在10 日龄哺育蜂和21 日龄哺育蜂咽下腺中的表达量均高于相应日龄采集蜂中的表达量，21 日龄哺育蜂咽下腺中的表达量显著高于21 日龄采集蜂中的表达量（P ＜0.05），且AmOBP17 基因的表达量在10 日龄和21日龄采集蜂咽下腺中表达量差异不显著（P ＞0.05）如图7（C）所示.
图7 AmOBP17基因在蜜蜂大脑、咽下腺、上颚腺中的表达量
典型的气味结合蛋白（OBPs）具有6 个半胱氨酸形成的3 个二硫键，用以维持其三级蛋白结构.文献报道在中华蜜蜂OBP10 的氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸残基［17］.通过生物信息分析，我们也发现西方蜜蜂AmOBP17 基因的氨基酸序列也存在6 个保守的半胱氨酸，表明OBPs 在不同昆虫中高度保守.
在昆虫嗅觉刺激的检测和识别方面，OBPs 具有重要的作用.同时，发现OBPs 具有新的功能，已初步应用于新药研发和环境中污染物的清除［18］.西方蜜蜂OBP14 可以与其他配体结合，比如高香草酸、香草酸甲酯以及丁子香酚的羟基结合［19］.中华蜜蜂OBP10 基因在毒腺中高量表达，同时也发现该基因在响应应激刺激中（如低温、H2O2、哒螨灵、灭多虫、吡虫啉、高温、紫外线、维生素C、HgCl2、氯化铬、百草枯和辛硫磷等）发挥重要作用［17］.蜜蜂中已鉴定了超过177 个OBP 基因，其中4 个基因（OBP10、OBP13、OBP14 和OBP17）在化学感受器较少的区域高量表达，表明其可能存在其他潜在的功能［19］.在本文中，时空表达谱显示 AmOBP17 基因在哺育蜂时期表达量达到峰值，同时该基因的表达量在哺育蜂脑部、上颚腺和咽下腺中的表达量均高于同日龄采集蜂脑部、上颚腺和咽下腺中的表达量.蜜蜂作为膜翅目昆虫的代表，其职能分工存在日龄依赖性.通常情况下，在出房后的2～3 周，工蜂从事巢内的活动，包括饲喂小幼虫，清理巢房等；
3周后，逐渐转变为在巢外活动的采集蜂，负责采集花粉、花蜜和水等.哺育幼虫是哺育蜂的主要职责.在此阶段，上颚腺和咽下腺是蜂王浆合成和分泌的主要器官，其中上颚腺主要负责分泌蜂王浆中的脂质成分（如10-羟基-2-癸烯酸），而咽下腺主要分泌蜂王浆中蛋白质.我们发现AmOBP17 基因在哺育蜂的上颚腺和咽下腺中高量表达，暗示该基因可能在哺育蜂蜂王浆合成和分泌过程发挥重要的作用.
由于基因编辑效率高和操作简单，基因组编辑技术已在昆虫基因功能研究中广泛应用.本团队前期已构建了西方蜜蜂基因编辑平台，成功获得了具有明显表型的yellow-y 突变体雄蜂和csd 突变体［20，21］.我们将利用基因组编辑平台深入阐明AmOBP17 基因在西方蜜蜂哺育蜂中发挥功能的分子机制.
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