基于盐度校正的中国河口铜水生生物水质基准研究?
马超群，李正炎，2，胡 泓，2，王秀海??，赵晓明，沈佳峰
(1.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100；
2.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100)
入海河口位于河流与海洋接触的交汇地带，是海洋生物的产卵地、育幼场、索饵场和洄游通道，发挥着重要的生态服务功能[1-2]。河口地区环境复杂，水质因子变化剧烈，陆源输入的重金属污染物在此迁移和转化，对河口生态系统构成威胁[3-4]。铜是常见的重金属污染物，在中国部分河口、邻近海域和水体沉积物中均有不同程度检出，由于咸淡水混合稀释、沿岸排污活动、风浪及潮汐作用等，呈现近岸向外海含量减少的趋势，具有一定的生态风险[5-10]。毒理实验表明，高浓度铜会干扰海洋微藻的营养盐代谢和光合作用[11]，引起海洋腹足类和枝角类的生长抑制和繁殖紊乱[12-13]，干扰鱼类组织细胞正常代谢[14]，改变细胞内环境的氧化还原状态，造成细胞死亡[15]。
水质基准(Water quality criteria，WQC)是指水环境中污染物质或有害因素对人体健康和水生态系统不产生有害效应的最大剂量或水平[16]，是制定水质标准的重要理论依据。20世纪80年代开始，美国等陆续颁布了重金属铜的水质标准系列文件，采用硬度校正法、水效应比等方式校正并更新铜的水质标准。中国铜水质基准研究起始于本世纪初，主要集中在淡水水质基准的推导及其生态风险评估[17-20]，缺少海水及河口铜的基准研究，尚未形成河口水质标准体系，水质管理混乱，因此迫切需要开展河口基准方面的研究。
近岸河口地区受人类活动影响较大，铜与陆源物质(如有机物等)发生络合反应，在水体中主要以络合物形式存在，也有少量游离态的铜。盐度、溶解性有机物、硬度等水质因子可通过改变游离铜离子活度而影响铜的毒性值，对基准推导产生影响[21-23]。河口地区淡盐水混合，具有盐度梯度[24-25]。Boyle等[26]发现，陆海界面的河口区域，铜的迁移转化行为也受盐度驱动的絮凝和沉降等过程的影响。目前研究表明，盐度与铜毒性效应存在密切联系，这主要由于阳离子的吸附性竞争[27-29]。本研究收集了中国河口本土物种的毒性数据并补充相关急性毒性试验，采用盐度校正法将急性数据校正于平均盐度水平(S=25)，推导中国河口铜水生生物水质基准，比较了4种门类生物(脊索动物门、软体动物门、节肢动物门和藻类)的类群敏感性并分析了盐度与其铜毒性效应的相关性，为中国河口区铜水质标准的制定提供理论和数据支持。
1.1 毒性数据的收集、筛选及处理
本文收集的数据来源于中国知网(http://www.cnki.com/)、美国环境保护局ECOTOX毒性数据库(http://cfpub.epa.gov/ecotox/)及其他公开发表的相关文献。文献中涉及的物种为中国河口的本土物种或者经过引进在中国河口广泛分布的物种，涵盖了初级生产者、初级消费者、次级消费者3个营养级，包括水生植物、无脊椎动物、脊椎动物。急性毒性试验以个体死亡(半数致死浓度LC50)或生长、发育和繁殖抑制(半数效应浓度EC50)；
慢性毒性数据的毒性效应终点为生长、发育和繁殖的无观察效应浓度(NOEC)或最低可观察效应浓度(LOEC)。
参考《淡水水生生物水质基准制定技术指南》[16]，对收集的数据进行可靠性判断筛选。筛选标准如下：①不能使用蒸馏水或去离子水作为实验用水设置对照实验，且对照组和实验组的条件应完全相同；
②在实验开始和结束时必须测定实验物质的浓度，实测浓度与名义浓度的相对标准偏差要小于20%；
③受试物种需要在实验室进行成功驯化养殖，便于进行实验室毒性实验；
④优先采用流水式实验获得的毒性数据，其次采用半静态或静态实验；
⑤同一受试物种的急性或慢性值相差10倍以上的值为边界外值，推导基准时需要将边界外的值剔除，如果无法确定哪个值是边界外值，则该物种的所有数据都不应该用于推导基准；
⑥所有急性毒性数据都需要有明确的受试盐度条件。本文采用实验过程完全符合实验准则的数据和不完全符合实验准则，但有充足的证据证明其可用的数据进行基准推导。
1.2 盐度校正
本文选择盐度作为影响因子进行校正。校正过程参考《淡水水生生物水质基准技术报告—镉(2020版)》[30]。假设铜对所有水生生物的急性毒性值都存在盐度关系，以盐度对数值为自变量，以毒性对数值为因变量，进行线性拟合，得出盐度校正斜率，根据该斜率将急性毒性数据进行校正，得到为标准盐度(S=25)下的急性毒性值。
1.2.1 试验材料 本实验所需的菲律宾蛤仔选购自青岛晓翁海鲜批发市场，鲻鱼捕于广东沿海地区。实验使用的化学试剂为CuSO4·5H2O，AR，实验前使用去离子水配置一定离子质量浓度母液，转移至棕色试剂瓶中，4 ℃避光保存，用于铜离子浓度的调节。人工海水由曝气48 h以上的自来水稀释海水晶获得，人工海水经高温消毒后，冷却备用。海水晶购自潍坊市坊子区海佳海水晶厂。
1.2.2 试验方法
1.2.2.1 菲律宾蛤仔急性毒性实验 菲律宾蛤仔适宜生存在盐度范围20～35，pH范围7.5～8.5，溶解氧5 mg·L-1以上，水温范围10～30 ℃的水体中。实验用菲律宾蛤仔的平均壳长为(3.0±0.3)cm，驯养水温为(17.3±0.5)℃，溶解氧为(7.9±0.5)mg·L-1，期间连续充氧，喂食螺旋藻粉。实验开始前一天停止喂食，并用相应Cu2+浓度的海水溶液浸泡烧杯内壁24 h以上，降低吸附。蛤仔驯养2 d后进行预实验，以确定最大无效应浓度及最低全致死浓度区间。在3 L容量烧杯中加入2 L曝气人工海水，每个烧杯分别随机放入经过驯化的10只菲律宾蛤仔，曝气培养。
根据预实验结果制定正式实验浓度梯度，即每个盐度下按等对数间距设置5个试验浓度(盐度20：1.28、3.04、7.21、17.11和38.40 mg·L-1；
盐度22：1.28、3.22、8.1、20.33和51.2 mg·L-1；
盐度26：2.56、5.73、12.83、28.72和64.00 mg·L-1；
盐度30：5.12、10.07、19.87、39.2和76.8 mg·L-1；
盐度32：7.68、14.39、25.60、45.52和89.60 mg·L-1)，外设一个空白对照组和一个溶剂对照组，每个盐度下每组浓度均设3组平行。正式暴露试验的持续时间为4 d，每24 h更换全部试验液，期间不投饵料，保证水质清洁。实验过程中随时观察并记录菲律宾蛤仔的死亡情况并及时取出死亡个体。判断死亡标准是双壳异常张开，外套膜萎缩，用玻璃棒触碰多次无反应。
1.2.2.2 鲻鱼急性毒性实验 鲻鱼适宜生存在盐度0～40，pH 7.7～8.7，溶解氧5 mg·L-1以上，温度范围12～35 ℃的水体中，实验所用鲻鱼的平均体长为(3.5±0.5)cm，驯养水温为(19.5±0.5)℃，溶解氧为(8.1±0.5)mg·L-1，整个试验期间连续充氧，喂鱼食。实验开始前一天停止喂食，用相应Cu2+浓度的海水溶液浸泡烧杯内壁24 h以上，降低吸附。鲻鱼暂养7 d后进行预实验，以确定最大无效应浓度及最低全致死浓度区间。实验开始前，在3 L容量烧杯中加入2 L曝气人工海水，每个烧杯分别随机放入经过驯化的8条鲻鱼，曝气培养。
根据预实验结果制定正式实验浓度梯度，即每个盐度下按等对数间距设置5个试验浓度(盐度10：2.56、5.29、10.92、22.55和46.08 mg·L-1；
盐度14：7.68、12.83、20.33、32.23和51.20 mg·L-1；
盐度20：12.8、19.20、28.72、42.98和56.32 mg·L-1；
盐度26：20.48、27.12、36.16、48.22和64.00 mg·L-1；
盐度32：25.6、34.14、45.52、60.71和76.80 mg·L-1)，外设一个空白对照组和一个溶剂对照组，对于每个盐度下每组浓度均设3组平行。正式暴露试验的持续时间为4 d，每24 h更换全部试验液，实验期间不投饵料，保证水质清洁。实验过程中随时观察记录鲻鱼的死亡情况并及时取出死亡个体。判断死亡标准是摄食及运动行为停止，鳃盖完全停止活动，用玻璃棒刺激其尾部无反应。
1.2.3 数据分析 采用SPSS Statistics 25，运用概率单位法分别计算菲律宾蛤仔和鲻鱼的96 h-LC50。采用Origin 2017，进行线性回归分析。
1.3 水质基准推导
根据《我国淡水水质基准制定指南》[16]推荐，本文采用SSD模型推导基准值。SSD模型采用效应浓度与受影响物种累积概率之间的关系曲线，描述不同物种对污染因子敏感性相互关系。毒性数据进行正态分布检验，将毒性值从小到大进行排序，计算每个物种的累积概率。SSD推荐使用逻辑斯蒂分布、正态分布、对数-逻辑斯蒂分布、对数-正态分布等模型进行数据拟合。不同模型拟合得到的基准存在一定差距，根据模型的拟合优度选择充分描绘数据分布情况的分布模型，确保推出的水质基准在统计学上具有合理性、可靠性。5%物种危害浓度(Hazardous concentration for 5% of species，HC5)是指受影响物种的累积概率达到5%时的污染物浓度，或95%的物种能够得到有效保护的污染物质浓度。SSD曲线上的HC5除以评估因子，即可确定最终的水生生物水质基准，评估因子根据推导基准的有效数据的数量和质量确定，一般取值为2～5，当有效毒性数据数量大于15并涵盖足够营养级时，评估因子取值为2。
2.1 不同盐度条件对两种水生生物急性毒性的影响
不同盐度条件下铜对菲律宾蛤仔和鲻鱼的96 h-LC50拟合情况如表1、2，图1所示。随着盐度增加，二者的96 h-LC50均增加，说明盐度增加减缓了铜的毒性效应，这可能是由于盐度增加，主要阳离子和金属与生物配体结合阳离子的竞争性相互作用，影响铜的生物利用度和毒性[35,36]。两条曲线拟合斜率不同，说明盐度对二者急性毒性影响程度不同。
表1 不同盐度条件下铜对菲律宾蛤仔96 h-LC50的拟合曲线
表2 不同盐度条件下铜对鲻鱼96 h-LC50的拟合曲线
图1 盐度对菲律宾蛤仔和鲻鱼的铜急性毒性效应的影响
2.2 不同门类生物的敏感度及受盐度影响分析
本文将搜集的脊索动物门、软体动物门、藻类、节肢动物门的急性数据建立类群特异性SSD并比较5%危险浓度，分析敏感度情况，其中对数逻辑斯蒂分布模型拟合效果最优，拟合信息如表3。类群特异性物种敏感度分布如图2，节肢动物门与藻类的拟合曲线在左侧，HC5相对较小，说明上述两类群相对敏感。软体动物门和脊索动物门拟合曲线在右侧，且HC5值较大，其中脊索动物门类群敏感度最低。盐度对上述门类生物铜毒性影响相关性分析如表4，相比软体动物门和脊索动物门，藻类与节肢动物门的铜急性毒性与盐度正相关程度较高，即盐度增加减缓了二者的铜毒性效应，软体动物门与脊索动物门相关程度较低，这可能是由于二者的类群敏感度相对较低。
图2 铜毒性的生物类群特异性敏感曲线拟合图
表3 对数逻辑斯蒂模型拟合信息
表4 盐度对不同门类生物铜毒性影响的相关性分析
2.3 盐度校正
选择以下12种符合拟合要求的急性数据进行拟合分析，拟合方程如表5所示，参考《淡水水生生物水质基准技术报告—镉(2020版)》[30]中的校正方式，进行盐度拟合校正，得到拟合斜率为1.678，R2=0.193。回归分析如图3。
表5 盐度对不同物种铜毒性的影响
图3 水体盐度对水生生物铜毒性影响的回归分析
2.4 收集的毒性数据
毒性数据搜集截止于2021年6月，如表6、7所示。急性数据共收集了72条，来自10门40科46种，主要为96 h-LC50或96h-EC50。慢性数据共收集了20条数据，来自6门14科16种，采用暴露时间不小于14 d的NOEC或LOEC。试剂主要为CuSO4·5H2O、CuCl2·2H2O、CuSO4·7H2O等。将急性数据的盐度校正为25，用于推导河口短期水质基准(Short-term water quality criteria，SWQC)。慢性数据不足，无法校正盐度，因此直接推导河口长期水质基准(Long-term water quality criteria，LWQC)。
表6 不同盐度条件下铜对中国河口水生生物急性毒性数据
2.5 基准推导
数据进行对数化处理符合正态分布，采用数据处理软件EEC-SSD内置的4种模型(正态分布模型、逻辑斯蒂模型、对数逻辑斯蒂分布模型、对数正态分布模型)进行基准推导，R2>0.6具有统计学意义，R2越接近1，说明毒性数据的拟合优度越大，模型拟合越精准。RMSE是回归系统的拟合标准差，RMSE越接近于0，说明模型拟合的精密度越高；
P(K-S)是一种拟合优度检验，P(K-S)>0.05表明模型符合理论分布。急性毒性值拟合结果如表8所示，正态分布模型、逻辑斯蒂模型、对数正态分布模型均能拟合出基准曲线，其中逻辑斯蒂模型拟合效果最好，拟合曲线如图4，HC5=5.37 μg·L-1，由于本研究的有效毒性数据数量大于15并涵盖足够营养级时，评价因子取2，得到短期水质基准SWQC=3.69 μg·L-1；
慢性毒性值的拟合结果如表9所示，对数正态分布模型拟合效果最好，拟合曲线如图5，HC5=6.02 μg·L-1，评价因子取2，得到长期水质基准LWQC=3.01 μg·L-1。
表7 不同盐度条件下铜对中国河口水生生物慢性毒性数据
表8 铜对中国河口生物急性毒性值的不同分布模型拟合结果
表9 铜对中国河口生物慢性毒性值的不同分布模型拟合结果
图4 铜对中国河口生物急性毒性值的物种敏感度分布曲线
图5 铜对中国河口生物慢性毒性值的物种敏感度分布曲线
3.1 环境因子对铜毒性效应的影响
盐度对于毒性效应影响是复杂的。通常增加盐度有助于减缓重金属的生物毒性。Rao等[107]采用细鳞鯻研究了盐度为22和32时铜、锌及其混合物的毒性，结果表明：铜在低盐度下的LC50值比在高盐度下的LC50值小2～3倍，锌在低盐度下的LC50值比在高盐度下的LC50值小1.1～1.7倍。本文研究的两个物种的急性值也随着盐度的升高而变大，这主要是由于低盐度条件下，Na+、K+、Ca2+等主要离子与铜的吸附性竞争作用增强，此时体液和环境之间的渗透压梯度也促进了溶解铜离子扩散进细胞，增加生物浓缩和富集能力，进而增加了生物毒性效应，因此高盐度可以作为一种保护因素用于抵御重金属毒性[108-109]。但对某些水生生物而言，在某一盐度范围内，盐度增加可能不会减缓其重金属毒性。Hall等[75]测定了近亲真宽水蚤在盐度分别为2.5、5、15、25时的96 h-LC50值，结果表明，盐度5的96 h-LC50值高于盐度15和盐度25下的96 h-LC50值，这是渗透胁迫最小化的作用，近亲真宽水蚤对等渗透盐度(5～10)条件下的有毒物质具有更强的抵抗力，因此生理特性也可能影响生物毒性。
在河口及海洋环境中，除了盐度之外，温度、pH、溶解性有机物、氧化还原电位、硬度和离子组成等均会对重金属的物理和化学行为造成影响。pH升高可能导致游离态铜浓度下降，水合态铜浓度升高，降低生物毒性。在较高的温度下毒物的作用往往更明显，这是由于温度对生物体的新陈代谢有刺激作用，较高的温度下生物代谢过程(如呼吸)的能量需求更大，产生生理应激反应，因此敏感程度增加；
Wang等[110]发现，铜、铅、硒和银4种重金属的毒性值和pH存在正相关关系；
DOM含量可能影响重金属的联合毒性。Gabriella等[111]研究表明：在不添加DOM的情况下，铜镍混合物对小球藻具有协同毒性，在低DOM浓度下，生物毒性取决于重金属浓度。随着DOM浓度的增加，重金属形态发生变化，混合物相互作用由协同作用转变为不相互作用或拮抗作用。
3.2 国内外关于铜的海水水质基准值研究
国内外关于铜的河口及海水水质基准如表10所示，本文的河口铜水质基准值采用双值基准体系，采用SSD模型拟合推导出SWQC和LWQC，保护中国河口95%以上的水生生物不受损害。SWQC是指短期暴露下能够保护河口水生生物及其生态功能的水质基准，LWQC是指长期暴露下能够保护河口水生生物及其生态功能的水质基准。SSD假设在生态系统中随机取样，充分利用了搜集的毒性数据，可以代表整个生态系统。美国的铜海水水质基准采用双值基准体系，运用SSR模型推导出基准最大浓度(Criteria maximum concentration，CMC)和基准连续浓度(Criteira continuous concentration，CCC)，CMC是在水中短期暴露而不使水生生物受到显著影响的最大浓度估算值，CCC是污染物在水中长期暴露而不使水生生物受到显著影响的最大浓度估计值。SSR考虑了污染物对于生物的累积效应，为95%以上的水生生物提供保护。澳大利亚与新西兰关于铜的海水水质基准采用单值基准体系，定义了不同可靠性等级的3类触发值(Trigger value，TV)，即高可靠性、中可靠性、低可靠性触发值，优先采用高可靠性触发值(High reliability trigger value，HRTV)作为水质基准。TV是长期接触条件下造成低生态风险的阈值，保护95%物种不受影响。
表10 国内外关于铜的河口及海水水生生物水质基准比较
美国采用19种水生生物急性毒性数据获得最终急性值(Final acute value，FAV)，除以评估因子2得到CMC。由于慢性水生生物毒性数据和急慢性比数据均仅有1条，因此无法计算最终慢性值(Final chronic value，FCV)。由于无重要的海水水生植物毒性数据，无法计算最终植物值(Final plant value，FPV)。由于最大允许组织浓度数据缺失，最终残留值(Final residue value，FRV)无法计算，因此最终CCC采用CMC的数值。本文直接采用慢性毒性数据推导的LWQC与CCC的数值接近，经盐度校正推导的SWQC的数值约为CMC的两倍。CMC推导过程并未考虑硬度�人室蜃咏行Ｕ疚牟捎昧搜味刃Ｕ欢ǔ潭壬辖档土搜味榷远拘孕вΦ挠跋臁MC的推导采用的物种均为美国本土的海水生物，本文推导的物种为中国本土或引进后广泛分布的中国河口水生生物，不同区系生物的组成结构及生理功能不同，对铜毒性敏感程度不同，导致毒性数据存在差距，因此基准值略有不同。本文推导的LWQC约是澳大利亚与新西兰推导的HRTV的两倍，原因可能为：澳大利亚与新西兰采用至少4科5种(3种物种野外NOEC和至少5种慢性NOEC)物种，本文用于推导基准的物种均为实验室内成功驯化养殖的河口生物，不包括物种的野外NOEC数据。澳大利亚与新西兰采用SSD中的Burr III模型拟合，结合评价因子10推导出HRTV，本文采用SSD中的对数正态分布模型直接拟合出LWQC，模型不同导致推导出的基准值存在差异。
增加盐度有利于减缓水生生物的铜毒性效应。随着盐度的增加，菲律宾蛤仔与鲻鱼的96 h-LC50随之增加。不同门类生物的类群敏感程度不同，毒性效应受盐度影响程度不同。相比软体动物门和脊索动物门，藻类与节肢动物门的铜类群敏感度相对较高，二者的盐度与急性毒性值的正相关程度相对较高，即盐度增加有利于减缓二者的铜毒性效应。本文获得的盐度校正斜率为1.678。采用SSD方式结合盐度校正法推导得出标准盐度水平下(S=25)中国河口水质基准值：SWQC=5.37 μg·L-1，LWQC=3.01 μg·L-1，与EPA、澳大利亚等国的海水水质基准值数值处于同一数量级，本文经盐度校正推导的SWQC的数值约为CMC的两倍，可能是由于本文采用了盐度校正，一定程度上降低了盐度对铜毒性效应的影响。本文推导的LWQC约是澳大利亚与新西兰推导的HRTV的两倍，可能是用于推导基准的物种来源不同，用于拟合基准值的模型也略有不同。本文仅对SWQC进行盐度校正，一定程度上减少了盐度对水质基准的影响，研究结果可以为后续开展BLM相关研究提供一定的理论支持。
每个河口都有独特的地貌特征和生态系统，因此需要针对不同的区域特征及主要环境问题制定不同的河口水质基准值，保障水体的服务功能。入海河口区铜的循环过程与近岸水体存在明显差异，因此制定其水质基准需要根据指定河口区域的水质特征进行修正，制定符合特定区域特征的基准值并时常更新。铜离子具有高度的活性，与水体中的碳酸盐、磷酸盐和腐殖酸盐等形成络合物沉淀，吸附于悬浮物及水体沉积物。加拿大等国制定了保护铜水生生物的沉积物质量指南，而中国的基准体系主要针对水体而言，因此后续应该开展沉积物基准研究，形成完整的河口及海洋基准体系。
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