蝉花菌质在饲料中应用的安全性研究
纪 伟， 苏文英， 刘晓梅， 柴文波*， 任立凯*， 闫文娟， 孙长胜， 陈克龙
（1.连云港市农业科学院，江苏连云港 222000；
2.青海师范大学，青海西宁 810000；
3.浙江泛亚生物医药股份有限公司，浙江嘉兴 314200）
蝉花（IsariacicadaeMiquel）是一种古老的虫草，具有丰富的营养价值（李增智等，2020；
刘爱英，2012）。蝉花子实体（人工培植）采收后剩余的培养基，在发酵过程中，培养基大部被分解转化，里面含有部分蝉花虫草菌丝体，故命名为蝉花菌质（纪伟等，2021）。研究表明，蝉花菌质不仅含有腺苷、多糖等活性成分，还含有丰富的氨基酸、微量元素、D-甘露醇和核苷类、维生素类、蕈糖和硬脂酸等物质（于士军等，2015；
于士军等，2014），具有广泛的药理作用（孙长胜等，2020）。开发应用这部分资源，不仅为蝉花子实体收获后留下的材料解决了出路问题，而且可变废为宝，提高蝉花培养物的附加值（昆都孜斯坎达尔等，2019）。
虫草作为饲料原料或饲料添加剂应用于养殖业逐渐成为研究热点，尤其是我国农业农村部第194号公告发布后，“减抗、替抗、无抗”转型升级已是大势所趋。虫草饲料添加剂属真菌类发酵产物，天然、无耐药性、无毒副作用、无残留，是一种新型的免疫增强剂，符合添加剂或饲料原料市场绿色、环保的发展要求，可作为免疫增强类饲料添加剂或饲料原料应用于畜禽毒性疾病的防治中，对我国实施的生态养殖和健康养殖具有非常重要的意义（纪伟等，2021；
李洋等，2019）。
本研究拟对大鼠连续染毒90 d，通过分析受试大鼠的食欲、饮水、增重、血液学指标、血液生化指标和病理学等指标，评价蝉花菌质的安全性，以期为蝉花菌质作为饲料添加剂或饲料原料提供科学理论依据。
1.1 蝉花菌质 蝉花人工培育完成后，将蝉花子实体采收剩余的小麦培养基，在发酵过程中，小麦培养基大部被分解转化，里面含有部分蝉花虫草菌丝体，该样品由浙江泛亚生物医药股份有限公司提供。
1.2 试验动物 健康无特定病原体（SPF）级斯普拉格-杜勒（SD）大鼠100只，雌雄各半，试验动物为4～5周龄，体重70～90 g，试验用SD大鼠购自北京为通利华动物科技有限公司，合格证号：SCXK（京）2016-0011。
1.3 主要试剂和仪器 甲醛水溶液（含量37%～40%，天津市大茂化学试剂厂）；
血液指示检测试剂（上海科华生物工程股份有限公司）；
稀释液（法国优德实验室公司）；
清洗液（含酶，法国优德实验室公司）；
BS2202电子天平（北京赛多利斯仪器公司）；
ELLIPSE全自动生化分析仪（法国优德公司）；
Hema starⅡ血细胞分析仪 （法国YESBAERT）；
切片机（美国Thermo）；
显微镜（日本奥林巴斯公司）。
1.4 染毒剂量与分组 根据受试物急性毒性试验结果，即半数致死量（LD50）大于5000 mg/kg体重，以及受试物加入饲料中最大量不能大于饲料量5%的限定，试验设50000 mg/kg饲料（高）、10000 mg/kg饲料（中）、2000 mg/kg饲料（低）三个剂量组，另设一个阴性对照组。每组20只SD大鼠（雌雄各半），雌雄大鼠的体重差异控制在平均体重的20%以内。
1.5 受试物的配制 将受试物加入到各剂量鼠维持饲料中，在饲料混合器中搅拌均匀后制成颗粒饲料，试验大鼠自由采食含有各剂量受试物的饲料，阴性对照组饲料中不添加受试物。
1.6 观察指标
1.6.1 一般观察 每日察看一次试验动物的健康状况，详细记录大鼠行为、眼口鼻是否有分泌物、粪便是否成形、是否腹泻或便秘及粪便颜色、毛发是否黯淡无光、竖毛，仔细检查各剂量组大鼠是否出现中毒症状及出现症状的时间、表现。假如发现死亡或濒死大鼠，需要立即进行相应检查，并对大鼠异常情况和死亡时间进行记录，对死亡动物及时剖检并取心、肝、脾、肺、肾、十二指肠等组织做病理切片。所有试验动物每5 d称量一次体重和采食量，饮水每天计量一次（Liu等，2020）。
1.6.2 血常规检查 在试验结束时（第90天），各试验组分别取5只雄性和5只雌性大鼠的血液，进行血红蛋白（Hg）、红细胞数（RBC）、白细胞数（WBC）、血小板数（PLT）、红细胞压积（HCT）、嗜酸性（EOS）、嗜碱性（BAS）、单核细胞（MO）、淋巴细胞（LY）等血液学指标检测（董飞飞，2017；
张淑慧，2015）。
1.6.3 血清生化检查 在血常规检查的同时对血清白蛋白（Alb）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、总胆固醇（TCH）、肌酐（Cr）、血糖（Glu）、总蛋白（TP）和甘油三酯（TG）等血液生化指标进行检测（Rasmus等，2022）。
1.7 病理检查
1.7.1 大体剖检 在试验结束时（第90天），各试验组分别处死5只雄性和5只雌性大鼠，进行大体剖检，如观察到可疑病变组织，应及时固定保存并进行组织学检查。大体剖检的同时，需称取体重及重要脏器重量，并计算心肝、肾、脾、肺、胃肠、睾丸及卵巢等脏器的脏器系数（Smitn等，2022）。
1.7.2 组织病理学检查 在试验结束时（第90天），各试验组分别处死5只雄性和5只雌性大鼠，取心、肝、脾、肺、肾、十二指肠用10%中性福尔马林溶液浸泡固定。对高剂量组和对照组试验鼠的心、肝、脾、肺、肾、十二指肠等主要脏器制作常规病理石蜡切片，HE染色进行组织病理学检查，如发现病变则需对较低剂量组试验鼠的相应组织器官进行组织病理学检查（宋翼升等，2017）。
1.8 统计分析 以t检验分析比较受试物各剂量组与阴性对照组之间的采食量、饮水量、日增重、血液学指标、血液生化指标及脏器系数等指标的差异显著性，如有动物某脏器发生病变、肿瘤或动物发生死亡现象，则病变率、肿瘤发生率、死亡率等计数资料采用X2检验分析其差异显著性。如分析结果为P值小于0.05，则判定其具有显著性差异。
2.1 一般观察 在试验期限（90 d）内，受试物高、中、低三个剂量组动物和阴性对照组动物均未见行为异常，并且其毛色顺滑，眼口鼻无分泌物，粪便形态正常（浅灰色）。
2.2 采食量 由图1可知，随着喂养时间增加各试验组采食量呈现增加趋势，喂养至50 d时采食量趋于稳定，受试物高、中、低三个剂量组平均日采食量分别较对照组提高了0.31%、0.89%、0.19%（P＞0.05），表明蝉花菌质在2000～50000 mg/kg饲料剂量内经自由采食连续给予大鼠90 d，对受试动物的采食量无显著影响。
图1 蝉花菌质对大鼠采食量的影响
2.3 饮水量 由图2可知，受试物高、中、低三个剂量组平均日饮水量分别较对照组提高了2.91%、2.48%、1.06%（P＞0.05），表明蝉花菌质在2000～50000 mg/kg饲料剂量内经自由饮水连续给予大鼠90 d，对受试动物的饮水量无显著影响。
图2 蝉花菌质对大鼠饮水量的影响
2.4 日增重 由图3可知，受试物高、低两个剂量组平均日增重分别较对照组提高了0.53%、0.26%（P＞0.05），受试动物中剂量组平均日增重较对照组降低了0.47%（P＞0.05），表明蝉花菌质在2000～50000 mg/kg饲料剂量对受试动物的增重无显著影响。
图3 蝉花菌质对大鼠平均增重的影响
2.5 血常规 从表1可以看出，受试物高剂量组、中剂量组、低剂量组动物在试验期间的血液学指标与阴性对照组的血液学指标无显著性差异（P＞0.05），表明蝉花菌质在2000～50000 mg/kg饲料剂量内经自由采食给予大鼠90 d，对受试动物的血液学指标无显著影响。
表1 喂养90 d时蝉花菌质对大鼠血液学指标的影响
2.6 血液生化指标 从表2可以看出，受试物高剂量组、中剂量组、低剂量组动物在试验期间的血液生化指标与阴性对照组的血液生化指标无显著性差异（P＞0.05），表明蝉花菌质在2000～50000 mg/kg饲料剂量内经自由采食给予大鼠90 d，对受试动物的血液生化指标无显著影响。
表2 喂养90 d时蝉花菌质对大鼠血液生化指标的影响
2.7 脏器系数 从表3可以看出，受试物高剂量组、中剂量组、低剂量组三个剂量组动物在试验期间的脏器系数均与阴性对照组无显著性差异（P＞0.05），表明经自由采食给予大鼠蝉花菌质对动物的心、肝、肾、脾、肺、胃肠、睾丸及卵巢等主要器官的脏器系数无显著影响。
表3 喂养90 d时蝉花菌质对大鼠脏器系数的影响
2.8 病理检查
2.8.1 大体剖检 在试验期限（90 d）内，受试动物未见发病和死亡现象，受试物高、中、低三个剂量组动物和阴性对照组动物的大体剖解均未见异常。
2.8.2 病变检查 从图4可以看出，受试物高剂量组动物和阴性对照组动物的上述脏器的组织切片均未见异常，表明在2000～50000 mg/kg饲料剂量内经自由采食给予大鼠蝉花菌质对受试动物的心、肝、脾、肾、十二指肠等主要脏器无不良影响。
图4 主要脏器组织切片图
本研究通过大鼠90 d喂养试验来开展蝉花菌质的安全性评价工作，蝉花菌质在2000～50000 mg/kg饲料剂量内连续染毒90 d对SD大鼠的食欲、饮水、增重、血液学指标、血液生化指标和病理学指标均无显著影响，在2000～50000 mg/kg饲料剂量内经自由采食给予大鼠蝉花菌质对受试动物的心、肝、脾、肾、十二指肠等主要脏器无不良影响。
蝉花作为一种古老的虫草具有一千多年的入药历史（李增智等，2020），蝉花子实体（人工培植）已于2021年国家卫健委批准为新食品原料，其安全性已经得到长期验证和认可，人工培养蝉花子实体的副产物蝉花菌质同样蕴含丰富的营养价值，可作为免疫增强类饲料添加剂或饲料原料应用于畜禽疾病的预防中，对我国实施的生态养殖和健康养殖具有非常重要的意义（纪伟等，2021；
李洋等，2019）。蝉花菌质所使用的菌株是经过严格的研究和筛选所得，其可以通过微生物发酵方法进行生产，不仅产量和营养价值高，且质量易控。通过蝉花菌质在饲料应用中的安全性研究，为今后蝉花菌质在饲料中应用提供科学理论依据（昆都孜斯坎达尔等，2019）。
本研究结果表明，蝉花菌质在2000～50000 mg/kg饲料剂量内连续染毒90 d，受试大鼠高、中、低三个剂量组平均日采食量、平均日饮水量、平均日增重较对照组均有一定提高，但以上均无显著性差异；
受试大鼠的血液学指标、血液生化指标和病理学指标与阴性对照组相比也均无显著性差异；
在试验中期和试验结束时对高剂量组及阴性对照组试验鼠的心、肝、脾、肾、十二指肠等主要脏器的组织切片观察，受试物高剂量组动物和阴性对照组动物的上述脏器的组织切片均未见异常。因此，本试验（90 d喂养试验）结果显示蝉花菌质在2000～50000 mg/kg饲料剂量内无亚慢性毒性。