LncRNA,KCNQ1OT1调节miR-145/PAK4轴对结直肠癌SW480细胞恶性发展的影响
施 文， 周志强， 蔡 明， 邱 建， 陈锦鹏， 何向锋， 孙永强
(南通大学第二附属医院/南通市第一人民医院胃肠甲乳外科， 江苏 南通 226000)
结直肠癌(CRC)是最常见的胃肠道肿瘤之一，近些年发病率不断上升。自20世纪90年代初以来，结直肠癌在年轻人中的发病率几乎翻了一番[1]。CRC筛查方案的实施提高了早期检出率，但许多CRC患者仍处于晚期，往往失去了治疗性切除的机会。因此，迫切需要研究新的生物标志物和靶点来改善结直肠癌的预后。长非编码RNA(lncRNA)是一种长度超过200个核苷酸、缺乏能够产生功能蛋白的开放阅读框的非编码转录本[2]。大量研究表明，lncRNA广泛存在于人类细胞中，在细胞周期调控、细胞分化、肿瘤发生等各种生物事件中发挥着重要作用[3]。lncRNA被发现是相互竞争的内源性RNA，它们吞噬miRNA并调节miRNA的靶标。越来越多的证据表明，lncRNA在包括CRC在内的各种癌症类型中存在失调，并且在所有癌症特征中都发挥着不可或缺的作用[4]。KCNQ1反链/反义转录本1 (Opposite Strand/Antisense Transcript 1，KCNQ1OT1)基因位于11p15.5，是lncRNA组的成员。KCNQ1OT1与染色质相互作用，通过表观遗传修饰调控多个靶基因的转录。目前，关于其在肿瘤中的异常表达和功能的研究报道较少。Feng等发现LncRNA KCNQ1OT1调控microRNA-9-LMX1A表达，抑制胃癌细胞进展[5]。Qiao等指出LncRNA KCNQ1OT1通过miR-124-3p/TRIM14轴参与舌癌顺铂耐药[6]。Li等发现LncRNA KCNQ1OT1通过靶向MiR-218-5p/HS3ST3B1促进膀胱癌的进展[7]。然而，KCNQ1OT1在CRC中的潜在分子机制尚未得到充分的研究。本研究旨在探讨LncRNA KCNQ1OT1在结直肠癌中的作用及其可能的机制研究，希望为结直肠癌患者的治疗找到新的理论靶点。
1.1临床标本：收集经组织病理学证实的CRC标本和术后患者匹配的正常组织，该研究得到了南通大学第二附属医院伦理委员会的批准以及患者书面知情同意。所有组织标本立即用液氮冷冻，置于-80℃保存至使用。
1.2方 法
1.2.1细胞系及细胞培养：人CRC细胞系SW480和正常结肠上皮细胞系CCC-HIE-2购自中国科学院细胞库。SW480在L15培养基(美国Invitrogen)中培养，CCC-HIE-2在Dulbecco’s modified Eagle’s培养基中培养。所有培养基均添加10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素(美国HyClone)。所有细胞系在37℃、5% CO2条件下培养。
1.2.2质粒来源及细胞转染：KCNQ1OT1和PAK4的干扰以及过表达质粒购自北京擎科生物有限公司，miR-145模拟物和抑制剂从GenePharma获得，根据制造商的说明，用Lipofectamine 3000(中国赛默飞世尔科技)转染质粒，用于后续实验。
1.2.3双荧光素酶报告基因检测：pmirGLO质粒购自优宝生物(中国湖南长沙)。将KCNQ1OT1和PAK4的扩增序列克隆到pmirGLO质粒中。将相应扩增的突变序列插入质粒中，与限制性内切酶位点ScaI和XbaI一起构建突变载体。将构建的KCNQ1OT1和PAK4野生型载体与miR-145模拟物一起转染到HEK293T细胞中，对照组细胞与模拟物对照质粒共转染，另外一组细胞共转染KCNQ1OT1和PAK4突变型载体与miR-145模拟物，最后检测并分析双荧光素酶活性。
1.2.4RNA分离及qRT-PCR检测：用Trizol试剂(Sigma-Aldrich)从组织或细胞系中分离总RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)，随机引物逆转录互补DNA(cDNA)。然后配置qRT-PCR反应体系，循环程序为98℃ 2min，98℃ 10s、60℃ 15s和65℃ 15s，40个循环。用公式2-△△Ct分析各目的基因的相对表达量。GAPDH为KCNQ1OT1和PAK4的内源性控制基因，U6为miR-145的内源性控制基因。引物信息见表1。
表1 引物序列
1.2.5MTT实验：离心收集培养的细胞，以1×106/mL重悬，100μL细胞悬液置于微滴板中。培养48h后，每孔加10μL MTT试剂，再孵育3h。每孔加入100μL洗涤试剂，避光孵育2h。最后，在450nm微滴定板上观察每个孔的光吸收度。所有试剂均购自Biomart(中国北京)。
1.2.6细胞克隆形成实验：用4mL 0.25%胰蛋白酶消化培养的细胞，接种在6孔板中，培养7d。当细胞形成可见菌落时，取出培养基，在平板上加入固定液2～3mL。5min后弃固定液，加入0.5%结晶紫(上海Sigma-Aldrich)溶液与细胞孵育2h，在显微镜下观察菌落。
1.2.7流式细胞仪分析细胞凋亡率：将细胞接种于24孔板中，孵育48h。收集上清液和贴壁细胞，使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(BD Biosciences)，用异硫氰酸荧光素-膜联蛋白V和碘化丙啶进行双重染色。将500μL细胞悬液与2μL Annexin(1mg/mL)和2μL碘化丙啶(1mg/mL)(CA1020，Solarbio，北京)孵育后，用流式细胞仪分析细胞凋亡率，将细胞区分为活细胞、死细胞、早期凋亡细胞和凋亡细胞，并比较各实验中凋亡细胞与对照转染细胞的相对比例。
1.2.8Western Blot检测蛋白表达：收集细胞，从转染细胞中提取蛋白，细胞蛋白裂解液用10% SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜，与特异性抗体孵育。以GAPDH抗体作为对照，anti-GAPDH和E-cadherin、N-cadherin购自Cell Signaling Technology。用超信号化学发光底物进行蛋白检测。
1.3统计学处理：采用GraphPad Prism 6.0软件进行数据分析。以上实验至少进行了三次。数据以均数±标准差表示，两组独立样本比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1LncRNA KCNQ1OT1、miR-145和PAK4在结直肠癌组织和细胞中的表达：结直肠癌组织中KCNQ1OT1、PAK4表达量高于癌旁组织(P<0.01)，miR-145表达量低于癌旁组织(P<0.01)；
SW480细胞中KCNQ1OT1、PAK4表达量高于CCC-HIE-2细胞(P<0.01)，miR-145表达量低于CCC-HIE-2细胞(P<0.01)，见图1和表2。
图1 qRT-PCR技术检测结直肠癌组织和细胞中LncRNA KCNQ1OT1、miR-145和PAK4的表达量
表2 不同组织和细胞中LncRNA KCNQ1OT1 miR-145和PAK4的差异表达量
2.2LncRNA KCNQ1OT1与miR-145以及miR-145与PAK4之间的关系：KCNQ1OT1和miR-145、miR-145与PAK4之间的结合位点见图2。KCNQ1OT1 WT+miR-145 mimics组荧光素酶活性低于KCNQ1OT1 WT+mimics NC组(P<0.01)，PAK4 WT+miR-145 mimics组荧光素酶活性低于PAK4 WT+mimics NC组(P<0.01)，KCNQ1OT1与PAK4突变后荧光素酶活性与对照组比无明显差异(P>0.05)，见表3。
表3 荧光素酶活性分析
图2 lncRNA KCNQ1OT1与miR-145、miR-145与PAK4之间的关系
2.3敲低KCNQ1OT1或PAK4表达对SW480细胞的增殖、凋亡及EMT的影响：与siRNA NC组相比，KCNQ1OT1 siRNA组和PAK4 siRNA组细胞增殖活力显著下调(P<0.05)；
与siRNA NC组相比，KCNQ1OT1 siRNA组和PAK4 siRNA组SW480细胞克隆数目显著减少(P<0.01)；
KCNQ1OT1 siRNA组和PAK4 siRNA组N-cadherin表达显著下调(P<0.01)，E-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.01)；
与siRNA NC组相比，KCNQ1OT1 siRNA组和PAK4 siRNA组细胞凋亡率显著上调(P<0.01)，见图3和表4。
表4 敲低KCNQ1OT1或PAK4表达后分析SW480细胞的增殖凋亡及
图3 敲低KCNQ1OT1或PAK4表达对SW480细胞的增殖、凋亡及EMT的影响A：敲低KCNQ1OT1或PAK4表达后MTT分析SW480细胞活力；
B：敲低KCNQ1OT1或PAK4表达后细胞克隆形成实验检测 SW480细胞克隆数目；
C：敲低KCNQ1OT1或PAK4表达后Western blot检测细胞EMT；
D：敲低KCNQ1OT1或PAK4表达后流式细胞仪检测细胞凋亡情况
2.4敲低miR-145表达对SW480细胞的增殖、凋亡及EMT的影响：与inhibitor NC组相比，miR-145 inhibitor组细胞增殖活力显著上调(P<0.05)，SW480细胞克隆数目显著增加(P<0.01)，E-cadherin表达显著下调(P<0.01)，N-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.01)，细胞凋亡率显著下调(P<0.01)，见图4和表5。
表5 敲低miR-145表达后分析SW480细胞的增殖凋亡及EMT
图4 敲低miR-145表达对SW480细胞的增殖、凋亡及EMT的影响A：敲低miR-145表达后MTT分析SW480细胞活力；
B：敲低miR-145表达后细胞克隆形成实验检测SW480细胞克隆数目；
C：敲低miR-145表达后Western blot检测细胞EMT；
D：敲低miR-145表达后流式细胞仪检测细胞凋亡情况
2.5LncRNA KCNQ1OT1表达上调通过miR-145对SW480细胞增殖、凋亡及EMT的影响：上调KCNQ1OT1表达后细胞增殖活力、细胞克隆数目、N-cadherin/GAPDH比值显著高于对照组(P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值和细胞凋亡率显著低于对照组(P<0.01)；
上调miR-145表达后细胞增殖活力、细胞克隆数目、N-cadherin/GAPDH比值显著低于对照组(P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值和细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)；
KCNQ1OT1与miR-145同时上调组细胞增殖活力、细胞克隆数目、N-cadherin/GAPDH比值显著高于miR-145单独上调组(P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值和细胞凋亡率显著低于miR-145单独上调组(P<0.01)，见图5和表6。
表6 LncRNA KCNQ1OT1表达上调通过miR-145对SW480细胞增殖凋亡及EMT的影响
图5 LncRNA KCNQ1OT1表达上调通过miR-145对SW480细胞增殖、凋亡及EMT的影响A：上调LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表达后MTT分析SW480细胞活力；
B：调LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表达后细胞克隆形成实验检测SW480细胞克隆数目；
C：调LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表达后Western blot检测细胞EMT；
D:调LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表达后流式细胞仪检测细胞凋亡情况
研究发现，LncRNA参与了许多细胞生物学发展过程，且LncRNA在癌症中的作用也得到了进一步证实。目前，许多作为内源性miRNA海绵的lncRNA已经被证明参与了CRC的恶性发展。如研究发现lncRNA SNHG11作为结直肠癌早期诊断和预后的新型生物标志物[8]。长链非编码RNA GAS5通过与YAP磷酸化和降解相互作用并触发YAP磷酸化和降解而抑制结直肠癌的进展。此外还发现LncRNA SNHG6通过靶向UPF1激活TGF-β/Smad信号通路，通过调控ZEB1诱导EMT，促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移[9]。鉴于LncRNA在结直肠癌发展中发挥的关键作用，揭示LncRNA新的作用机制对于防控结直肠癌具有深远意义。有文献报道LncRNA KCNQ1OT1参与了舌癌、胃癌等肿瘤的发展进程，此外还有研究发现LncRNA KCNQ1OT1在结直肠癌中表达上调，通过cAMP信号通路调控miR-760/PPP1R1B，增强结直肠癌细胞对甲氨喋呤的耐药[10]，表明LncRNA KCNQ1OT1与结直肠癌等肿瘤恶性发展息息相关。因此为了深入LncRNA KCNQ1OT1在结直肠癌的作用机制，本研究首先检测了结直肠癌组织和细胞中LncRNA KCNQ1OT1的表达情况，结果发现探讨结直肠癌组织中KCNQ1OT1表达量高于癌旁组织，SW480细胞中KCNQ1OT1表达量高于CCC-HIE-2细胞，而本研究结果与之前的研究结果一致，LncRNA KCNQ1OT1在结直肠癌组织和细胞中表达显著上调。接下来研究LncRNA KCNQ1OT1的作用机制，敲低LncRNA KCNQ1OT1表达后，进一步检测了SW480细胞的增殖活力与EMT能力，结果发现下调其表达通过促进癌细胞凋亡显著抑制了结直肠癌细胞的增殖和EMT，LncRNA KCNQ1OT1在结直肠癌细胞发展中发挥了明显的抑癌作用，这与LncRNA KCNQ1OT1在舌癌、胃癌和膀胱癌中的功能相吻合。
越来越多的研究发现LncRNA通过靶向miRNA发挥作用，受此启发，本研究预测了LncRNA KCNQ1OT1的下游作用靶点，结果发现LncRNA KCNQ1OT1与miR-145具有直接的靶向作用。miRNA是非编码RNA家族的成员，在转录后基因调控中发挥着重要作用。大量研究表明，miRNA参与了肿瘤的形成和发展，提示它们可以发挥致癌或抑制肿瘤的作用。miR-145在癌症发展过程中的作用机制在既往研究中得到越来越多的探讨。Zhang等发现，miR-145通过抑制RAB5C在乳头状甲状腺癌中发挥抑癌作用[11]。Li等发现在卵巢癌细胞中，miR-145通过c-myc和dnmt3a介导的甲基化促进miR-133b的表达。Wang等研究表明miR-145通过靶向ADAM19改变非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感性[12]。本研究发现miR-145在结直肠癌组织和细胞中显著低表达，下调miR-145通过抑制SW480细胞凋亡显著促进细胞增殖和EMT。以往的研究揭示了lncRNA-miRNA-mRNA轴在包括CRC在内的各种癌症中的不同调控机制。Xi等表明LncRNA LINC01278通过miR-134-5p/KDM2A轴加速大肠癌进展[13]。Qian等研究发现lncRNA LUNAR1通过靶向miR-495-3p/MYCBP轴加速大肠癌进展[14]。同样，本研究证实了KCNQ1OT1的下调通过增加miR-145的表达来抑制PAK4的表达，从而抑制了SW480细胞的增殖和转移。本研究进一步阐明了KCNQ1OT1/miR-145/PAK4网络在结直肠癌中的调控机制。尽管我们的发现为KCNQ1OT1的下游靶点提供了新的见解，未来需要进行更多的研究，进一步阐明生物标志物的治疗和预后价值。
综上所述，本研究证实了lncRNA KCNQ1OT1在结直肠癌中的表达显著增加，并且KCNQ1OT1似乎通过调控miR-145/PAK4轴发挥致癌基因的作用。这些发现为早期检测患者提供了一种新的预后生物标志物，也为CRC患者提供了一个潜在的治疗靶点。
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