当归补血汤调节自噬干预心肌梗死模型大鼠心肌损伤的作用机制
陈 前，申楚翘，程 凯，袁慧伦，叶 树，申国明，江爱娟
(1.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012；
2.安徽中医药大学第一附属医院药学部，安徽 合肥 230031)
心肌梗死是因暂时或永久性冠状动脉闭塞，导致负性心肌重构、收缩功能障碍、心肌坏死、心律失常，甚至心力衰竭的一种严重的心血管疾病[1]。心肌梗死的发病机制复杂，包括氧化应激、钙超载、线粒体紊乱、细胞自噬、炎症反应等。
自噬是普遍存在于真核生物细胞中的一种生理现象，在高血压病、心力衰竭、心肌梗死等疾病的发病方面起着非常重要的作用[2]。研究[3]表明，自噬通过降解错误折叠蛋白、减轻线粒体功能障碍和抑制氧化应激维持心脏功能并减少心肌损伤。因此，自噬对心脏稳态和功能至关重要。
磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路是介导自噬的经典信号通路，有研究[4]表明，其与心血管疾病的病理进程有密切关系。自噬功能的增强有利于心肌梗死的治疗[5]。促进心肌梗死中自噬的发生是缓解心肌细胞死亡和保护心功能的一种有效方法。
当归补血汤由黄芪、当归两味中药组成，功能益气补血、活血化瘀，用于治疗心血管疾病[6]。有研究[7]发现，当归补血汤可以通过抑制心肌细胞凋亡改善心脏病理学改变。且当归补血汤预处理还可以通过增加心肌细胞对氧化应激损伤的抵抗力，提供更有效的心脏保护[8]。还有研究[9]发现，当归补血汤通过促进线粒体自噬改善线粒体功能，抑制心肌细胞凋亡从而改善慢性间歇性低氧小鼠心功能。这些研究结果表明，当归补血汤可以调节受损心肌的自噬，起到保护心脏的作用，但是其机制尚不明确。本实验通过观察当归补血汤预给药对冠状动脉左前降支结扎致心肌梗死大鼠心肌损伤、病理改变和PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响，探究其调节自噬改善心肌梗死大鼠心肌损伤的作用机制，为临床防治心肌梗死提供实验依据。
1.1 动物 50只SPF级SD大鼠，体质量180～220 g，雄性，购自江苏省邳州市东方养殖有限公司[生产许可证号：SCXK(苏)2017-003]，实验室饲养温度为(23±2)℃，湿度为40%～70%。
1.3 试剂 TTC粉(货号 T8170)：北京索莱宝科技有限公司；
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(货号 A020-2)：南京建成生物工程研究所；
肌酸激酶心肌型同工酶(creatine kinase-myocardial band，CK-MB)试剂盒(货号 JL12296)：上海江莱生物科技有限公司；
磷酸化PI3K(phosphorylate PI3K,p-PI3K)兔抗大鼠抗体(批号 BS4605)：美国Bioworld公司；
磷酸化AKT(phosphorylate AKT,p-AKT)兔抗大鼠抗体(批号 4060S)、磷酸化mTOR(phosphorylate mTOR, p-mTOR)兔抗大鼠抗体(批号 5536S)、LC3A/B兔抗大鼠抗体(批号 4108S)、Beclin-1兔抗大鼠抗体(批号 3495T)、p62兔抗大鼠抗体(批号 39749T)：美国Cell Signaling Technology公司；
GAPDH(批号 TA-08)：北京中杉金桥生物技术有限公司；
ECL超敏发光试剂盒(货号 BL520B)：中国Biosharp公司。
1.4 仪器 病理切片机(RM2016)：上海徕卡仪器有限公司；
光学显微镜(Eclipse E100)：日本尼康公司；
电泳仪(EPS300)：上海天能科技有限公司；
凝胶成像系统(JS-M6P)：上海培清科技有限公司。
2.2 动物取材 复制模型24 h后，用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，从腹主动脉取血，随后取出大鼠心脏，清洗并剔除非心肌组织后用滤纸吸干水分。每组随机挑选3只大鼠心脏做TTC染色，取每组剩余大鼠心脏结扎部位以下部分组织，置于4%多聚甲醛中固定；
取大鼠左心室梗死区组织，置于-80 ℃冰箱备用。
2.3 心肌梗死面积检测 取剔除非心肌组织后的心肌组织，自冠状面切成4～5片2～3 mm厚的切片，放入37 ℃预温的2% TTC染液中，染色10～15 min后取出，白色代表梗死组织。采用Image J(1.51J8)分析梗死面积。以白色梗死面积与全切片面积的百分比作为梗死面积。
2.4 心脏的组织形态观察 取出用4%多聚甲醛固定的心脏，常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，光学显微镜下观察心脏的组织形态。
2.5 血清LDH和CK-MB检测 从腹主动脉取血，2 500 r/min离心10 min，取上清液，用生化试剂盒检测血清LDH水平，用ELISA试剂盒检测血清CK-MB水平。
2.6 Western blot检测心肌组织PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及自噬相关蛋白表达水平 从-80 ℃冰箱中取出大鼠心脏，选取左心室梗死区心脏组织用于提取总蛋白，用BCA对组织蛋白定量后，加入蛋白上样缓冲液混合，沸水浴加热5～10 min后，于SDS-PAGE凝胶中进行电泳并转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，用TBST洗10 min，共3次，分别与p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin-1的一抗(1∶1 000)孵育，4 ℃过夜，次日从一抗中拿出条带，用TBST洗10 min，共3次，然后放入对应的二抗，室温孵育1.5～2 h。TBST洗10 min，共3次，再加入ECL发光试剂显影、定影。以目标蛋白灰度值与内参的灰度值比值作为蛋白的相对表达水平。
注：A.假手术组；
B.模型组；
C.当归补血汤低剂量组；
D.当归补血汤高剂量组；
E.地尔硫组
表1 5组大鼠心肌梗死面积比较
注:A.假手术组;B.模型组;C.当归补血汤低剂量组;D.当归补血汤高剂量组;E.地尔硫组
表2 5组大鼠血清CK-MB、LDH水平比较
注：A.假手术组；
B.模型组；
C.当归补血汤低剂量组；
D.当归补血汤高剂量组；
E.地尔硫组；
与假手术组比较，*P<0.05；
与模型组比较，#P<0.05；
与当归补血汤低剂量组比较，△P<0.05
注：A.假手术组；
B.模型组；
C.当归补血汤低剂量组；
D.当归补血汤高剂量组；
E.地尔硫组；
与假手术组比较，*P<0.05；
与模型组比较，#P<0.05；
与当归补血汤低剂量组比较，△P<0.05
心肌梗死属于中医学“真心痛”“胸痹”等病范畴，其主要病机为气血阴阳不足，邪闭心脉，不通则痛[10]。《难经·十四难》云：“损其肺者，益其气；
损其心者，调其荣卫；
损其脾者，调其饮食。”故治疗胸痹心痛当调其气血。当归补血汤出自李东垣《内外伤辨惑论》，方中黄芪大补肺脾之气，以滋生化之源；
当归养血和营，两者合用，气血双补。本实验中，模型组大鼠出现明显心肌梗死，心肌细胞破裂、心肌纤维排列紊乱、大量炎症细胞浸润，且血清CK-MB和LDH水平明显升高，提示模型复制成功。当归补血汤干预后，大鼠心肌梗死面积缩小，心肌损伤程度减轻，血清CK-MB和LDH水平降低，提示当归补血汤有明显改善大鼠心肌梗死的作用。
自噬是一个高度保守的自我降解过程，参与心血管疾病等多种疾病，与心肌梗死的发生密切相关。有研究[11]发现，发生心肌梗死时，线粒体中自噬小体受损，心肌细胞大量凋亡，而适当促进自噬能清除凋亡的细胞以保护受损的心脏。据报道[12]，Beclin-1可促进脂质膜延伸、物质募集和自噬体成熟，是心脏中关键的自噬调节器。Beclin-1、LC3、p62蛋白参与自噬小体的形成与自噬溶酶体降解的过程，也因此成为经典的自噬标志物。自噬小体的减少会导致Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平降低[13]，而p62蛋白由于细胞无法正常形成自噬溶酶体并进行降解而表达水平升高[14]。本研究结果显示，心肌梗死后Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平降低，而p62表达水平升高。这些结果表明，心肌梗死后自噬功能显著受损。相反，当归补血汤可逆转心肌梗死诱导的这些自噬相关蛋白表达水平的紊乱，表明当归补血汤可以激活自噬以发挥其心脏保护作用。
增强的心肌细胞自噬可由PI3K/AKT/mTOR信号通路介导[15]，PI3K可以在自身磷酸化后活化，将磷脂酰肌醇磷酸磷酸化为磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol triphosphate，PIP3)。PIP3结合3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1进行磷酸化，激活下游分子AKT，而磷酸化AKT的产生会激活雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)。当mTORC1水平上升时，mTORC1通过对Unc-51自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)进行抑制性磷酸化，导致无法启动自噬小体的形成过程[16-17]。本研究结果显示，模型组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平明显升高，表明发生心肌梗死时PI3K/AKT/mTOR信号通路被激活，导致自噬的形成过程受到抑制，而当归补血汤能明显降低p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达水平。结果表明，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，在一定程度上促进自噬从而达到保护受损心肌的作用。
综上所述，当归补血汤可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进自噬的形成，激活细胞自噬，从而保护心肌梗死引起的心肌损伤，但其具体机制尚需进一步研究。
猜你喜欢磷酸化低剂量心肌细胞左归降糖舒心方对糖尿病心肌病MKR鼠心肌细胞损伤和凋亡的影响世界科学技术-中医药现代化(2022年2期)2022-05-25活血解毒方对缺氧/复氧所致心肌细胞凋亡的影响世界科学技术-中医药现代化(2021年7期)2021-11-04ITSN1蛋白磷酸化的研究进展天津医科大学学报(2019年6期)2019-08-13磷酸化肽富集新方法研究进展分析化学(2017年12期)2017-12-2516排螺旋CT低剂量扫描技术在腹部中的应用中国医药指南(2017年3期)2017-11-13心肌细胞慢性缺氧适应性反应的研究进展海南医学(2016年8期)2016-06-08自适应统计迭代重建算法在头部低剂量CT扫描中的应用天津医科大学学报(2015年2期)2015-12-22槲皮素通过抑制蛋白酶体活性减轻心肌细胞肥大中国病理生理杂志(2015年8期)2015-12-21MAPK抑制因子对HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核转位的影响安徽医科大学学报(2015年9期)2015-12-16低剂量辐射致癌LNT模型研究进展肿瘤预防与治疗(2015年1期)2015-09-26