肾细胞癌患者血清miR-135b-5p表达变化的价值及功能*
王榕，王成,，陈阳，丁小宇，张春妮，张辰宇，汪俊军
(1.南京医科大学金陵临床医院&东部战区总医院检验科，南京210002；
2. 南京大学生命科学院，南京210046)
肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是一种起源于肾小管上皮的泌尿系统恶性肿瘤，发病机制尚不明确[1]。最新流行病学调查显示，我国RCC年发病人数和死亡人数分别为77 410 人和 46 345人[2]。目前临床上仍缺乏特异性分子诊断和筛查标志物，因此寻找具有潜在临床应用前景的RCC分子标志物显得尤为迫切。微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是一类内源性非编码小RNA，在RCC的发生、发展中发挥重要作用[3]。人外周血循环中存在丰富、稳定表达的miRNA，可作为潜在的肿瘤生物学标志物[4]。循环miRNA还可被包裹于细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)并被携载进入受体细胞，发挥重要的生理、病理功能。miR-135b-5p转录本位于人类 1q32.1位点，在哺乳动物中高度保守。Nagel等[5]于2008年首次发现miR-135b在结直肠腺瘤和结直肠癌中呈高表达。迄今，大量研究证实其可通过调节癌细胞的增殖和迁移，促进胰腺癌[6]和胃癌[7]等肿瘤的发生、发展，提示miR-135b具有作为恶性肿瘤分子标志物及治疗靶点潜能，但miR-135b-5p在RCC患者血清、细胞系及细胞分泌的EVs中的表达变化和临床价值尚不清楚；
同时，RCC患者血清中miR-135b-5p是否参与肿瘤发生、发展亦不明确。因此，本研究通过进一步检测RCC患者血清中miR-135b-5p表达水平变化，并开展系列体外细胞试验，初步探讨其参与RCC的作用机制，明确RCC患者血清中miR-135b-5p水平变化、临床应用价值及作用机制，以期为RCC诊治提供新的思路和实验依据。
1.1研究对象
1.1.1血清标本来源 收集2022年1月至6月东部战区总医院泌尿外科初收的RCC患者60例，男性44例，女性16例，年龄(56.45±9.81)岁。所有患者均经病理活检确诊且未经过治疗，排除肾囊肿、肾良性肿瘤及其他肾脏疾病。确诊的RCC患者中肾透明细胞癌45例，肾嗜酸性细胞腺癌5例，肾乳头状细胞癌4例，嫌色细胞癌4例和基因融合相关性肾细胞癌2例。另收集同期体检健康者60例，男性42例，女性18例，年龄(46.10±15.47)岁。
1.1.2细胞系来源 人源正常肾小管上皮细胞系HK-2、人源肾腺癌细胞系ACHN、人源透明细胞癌细胞系Caki-1均购自美国模式培养集存库(American type culture collection，ATCC)；
HUVEC购自上海瑾原生物科技有限公司。
1.2仪器与试剂 Trizol试剂(美国Life Technologies公司)，氯仿、异丙醇、无水乙醇(上海国药集团试剂公司)，酸性酚(北京索莱宝公司)，3 mol/L(pH=5.5)醋酸钠(美国Thermo Fisher Scientific公司)， exoEasy Maxi Kit(德国Qiagen公司)， DEPC水、RIPA裂解液(上海Beyotime公司)，qRT-PCR引物及TaqMan探针(美国ABI公司)，qRT-PCR体系试剂(大连TaKaRa公司)，DMEM、McCoy′s5A培养基、胎牛血清(美国Corning公司)，鼠抗血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)单克隆抗体、羊抗鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)，miRNA NC和mimics(广州锐博生物技术有限公司)。418型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，TL988-Ⅳ 96实时荧光定量PCR仪(西安天隆科技有限公司)。
1.3方法
1.3.1细胞培养上清EVs提取 当1.1.2中各细胞融合度达70%～80%时，PBS洗涤2次，更换为无血清培养基继续培养48 h后，收集16 mL培养上清，按照exoEasy Maki Kit提取试剂盒说明书操作，从细胞培养上清中分离EVs后重悬于400 μL XE Buffer中待用。
1.3.2细胞与细胞EVs总RNA提取及逆转录反应 采用Trizol法提取细胞总RNA。取重悬于400 μL XE Buffer的细胞EVs，待细胞提前培养至融合度达80%～90%时，用预冷PBS洗涤2次，分别加入1.0 mL Trizol试剂和200 μL氯仿，后续按照Trizol试剂说明书提取，RNA沉淀溶于20 μL DEPC水，用全波长酶标仪测定浓度和纯度并用DEPC水稀释至0.5 μg/μL，随即进行逆转录反应，cDNA样本置于-80 ℃保存备用。
1.3.3血清总RNA提取 血清RNA提取采用本课题组前期建立的苯酚—氯仿一步法[8]，提取的RNA沉淀溶于20 μL DEPC水，并置于-80 ℃保存。
1.3.4miRNA水平检测 细胞、细胞EVs和血清miRNA水平检测采用基于TaqMan探针的qRT-PCR法进行，具体的反应体系和反应参数参照本课题组前期研究[8]进行。血清、细胞及EVs miRNA水平测定均以miR-16为内参照，细胞和细胞EVs miRNA表达水平以2-ΔΔCt法计算，公式：ΔCt=CtmiR-135b-5p-CtmiR-16，ΔΔCt=CtACHN/Caki-1-CtHK-2，血清miRNA表达水平以2-ΔCt法计算，公式：ΔCt=CtmiR-135b-5p-CtmiR-16。
每个Ct值为相应样本重复测定3次后所得均值，同时以不含RNA的模板的ddH2O水作为阴性对照。
1.3.5RCC细胞分泌的EVs与HUVEC共培养 取对数生长期的HUVEC细胞接种于6孔细胞培养板，待细胞生长至融合度达80%时，每孔2 mL培养基中加入100 μL RCC EVs，与HUVEC共培养24 h后进行后续试验。
1.3.6miRNA的过表达 取对数生长期的HUVEC细胞接种于6孔细胞培养板，待生长至融合度达80%～90%时，随机分成两组，分别转染无义对照序列(NC组)和miRNA模拟剂(miR135b-5p-mimics组)，按照Lipofectamine 3 000转染试剂说明书进行瞬时转染，每孔转染浓度为50 nmol/L，转染剂量为每孔250 μL，转染6 h后更换新鲜培养基继续培养24 h或48 h，即可进行后续试验。
1.3.7Western blot检测 取对数生长期的各组细胞，细胞裂解液充分裂解，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清，按照BCA试剂盒说明书操作测定蛋白质浓度。若蛋白质浓度相差过大，需要将蛋白质浓度调平。将调整后样品加入loading buffer煮沸10 min，分装备用。步骤如下，电泳：配制125 g/L PAGE凝胶，加入蛋白质样品10 μg，maker 5 μL，80 V浓缩，120 V分离。转膜：PVDF膜浸泡于甲醛1 min，按照黑色版—纤维垫—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—纤维垫—白板依次放置夹紧，在电泳槽的快速转膜液中400 mA转膜40 min。封闭：在快速封闭液中室温摇床封闭1 h，PBST洗膜4次，每次10 min。抗体温育：加入ANGPTL4鼠单克隆抗体(稀释度1∶3 000)和α-Tubulin鼠单克隆抗体(稀释度1∶5 000)，4 ℃温育过夜，PBST洗膜后加入IgG二抗(TBST稀释1∶5 000)室温温育2 h，PBST洗膜4次，每次10 min。曝光：ECL发光A液与B液1∶1混合，均匀滴加在PVDF膜上，置于化学发光成像仪中进行曝光。结果使用ImageJ软件进行分析。
1.3.8HUVEC成环试验 提前在4 ℃下预冷24孔板、200 μL枪头及基质胶，在24孔板中用基质胶布孔后，置于细胞培养箱30 min使其凝固，期间将预处理的HUVEC用2.5 g/L胰蛋白酶消化离心并重悬，用牛鲍式计数板计数约10万个细胞，置于提前凝固的基质胶中，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h时分别拍照5个视野，计数每个视野中HUVEC形成的闭环个数。
1.3.9miR-135b-5p的生物信息学预测 运用Targetscan软件预测和分析miR-135b-5p靶基因，进一步运用RNAhybrid软件预测miRNA与靶基因结合位点及自由能，若折叠自由能<-20.0 kcal/mol[9]，则提示miRNA对靶基因具有较强的结合与调控作用。
2.1RCC患者血清miR-135b-5p的表达水平 qRT-PCR结果显示，miR-135b-5p在RCC患者血清中的表达水平[6.932(5.524，9.964)]较健康人对照组[5.534(4.373，6.555)]明显升高，两组间差异有统计学意义(U=1 042，P<0.01)。
2.2ROC曲线分析 结果显示，血清miR-135b-5p能够很好地区分健康人对照和RCC患者，ROC曲线下面积(AUCROC)为0.711(95%CI：0.619 ～ 0.802)，当cut-off值为6.67时，miR-135b-5p筛查RCC的敏感性和特异性分别为55%和78.3%(图1)。
图1 血清miR-135b-5p对RCC筛查的ROC曲线
2.3RCC细胞和细胞分泌EVs中miR-135b-5p的表达水平 qRT-PCR结果显示，ACHN和Caki-1细胞中miR-135b-5p的表达水平较正常HK-2细胞明显升高，差异具有统计学意义(分别升高了7.821倍和1.919倍，P值分别为0.000 3和0.000 1)；
ACHN和Caki-1 EVs中miR-135b-5p的表达水平较HK-2 EVs亦显著增高，差异具有统计学意义(分别升高了3.783倍和2.627倍，P值分别为0.000 1和0.000 4)。
2.4RCC细胞分泌的富含miR-135b-5p EVs可促进HUVEC成环 成环试验显示，与对照组相比，RCC细胞分泌的富含miR-135b-5p EVs在不同时间点(4 h 、6 h和8 h)均可明显促进HUVEC成环能力，差异具有统计学意义(P值分别为0.011 2，0.005 7，0.001 7)。见图2。
注：*，P<0.05。
2.5生物信息学分析 应用RNAhybrid软件预测发现miR-135b-5p在ANGPTL4的3′非翻译区(3′UTR)处具有潜在的结合位点。其最小自由能为-23.1 kcal/mol，种子序列区域内有10个碱基完全互补配对。见图3。
图3 miR-135b-5p与候选靶基因的mRNA 3′UTR结合位点及自由能
2.6miR-135b-5p对ANGPTL4蛋白表达的影响 HUVEC经miR-135b-5p过表达后，qRT-PCR检测证实，mimics组细胞分泌的EVs中 miR-135b-5p的表达水平(139.50±17.12)显著高于NC组(0.137±0.001)，差异有统计学意义(t=14.05，P=0.000 1)。进一步运用Western blot检测HUVEC中ANGPTL4蛋白表达水平变化，发现mimics组ANGPTL4蛋白的表达水平为(0.616±0.003)，较NC组(1.00±0.05)显著降低，差异具有统计学意义(t=12.44，P=0.000 2)。见图4。
图4 HUVEC过表达miR-135b-5p对ANGPTL4蛋白表达的影响
2.7miR-135b-5p对血管形成的影响 成环试验结果表明，转染miR-135b-5p mimics组与NC组相比，在2 h、4 h、6 h、8 h时的成环数均明显增加，差异具有统计学意义(P值分别为0.000 1，0.000 1，0.003 2，0.009 5)。见图5。
注：*，P<0.05。
2.8年龄、性别对血清miR-135b-5p的水平影响分析 为探讨年龄、性别是否影响miR-135b-5p的水平，对不同年龄(≥46.1岁vs<46.1岁)、性别(男性vs女性)健康人对照者组别间血清miR-135b-5p的水平差异进行分析，结果显示不同年龄[5.579(4.081，6.394) vs 5.489(4.681，7.030)]、性别[5.534(4.386，6.359) vs 5.687(4.191，9.996)]组别间的差异无统计学意义(P值分别为0.371 1，0.456 7)。
血清miRNAs对于RCC临床诊断和预后具有潜在价值。报道显示，与健康人对照相比，肾透明细胞癌(ccRCC)患者血清中miR-122-5p和miR-206的表达水平显著降低。此外，高miR-122-5p和miR-206血清水平与ccRCC患者的无进展期、癌症特异性和总生存期较短相关[10]。本课题组前期研究发现，5种血清miRNA组合包括miR-193a-3p、miR-362、miR-572、miR-28-5p和miR-378对RCC的早期筛查具有一定的价值[8]。此外，miR-196a-5p在较高 Fuhrman分级的RCC患者血清中显著下调；
血清miR-429的表达水平显著高于对照组，且患者血清miR-429 水平与常规治疗后的临床结果之间存在相关性[11]。本研究结果显示，RCC患者血清中miR-135b-5p的表达水平显著高于健康人对照者，结合ROC曲线分析提示其具有作为RCC非侵入性分子辅助筛查标志物的潜能；
进一步体外细胞试验发现，RCC细胞系及细胞分泌EVs中miR-135b-5p的表达水平较对照组细胞及细胞分泌EVs亦显著升高，且表达变化趋势一致，说明RCC可以分泌含miR-135b-5p的EVs进入血管内皮细胞并促进血管成环，参与RCC发生、发展。
既往研究已证实，miR-135b-5p可参与多种肿瘤的发生、发展。Zhang等[12]发现miR-135b-5p 在胰腺癌组织和细胞系中的上调表达，且通过靶向NR3C2促进胰腺癌细胞的迁移、侵袭和EMT。人胃癌(GC)组织中miR-135b-5p的表达上调，且通过靶向 Krüppel样因子4(KLF4)，促进胃癌细胞的活力、增殖、迁移和侵袭[13]。相反，在恶性黑色素瘤(MM)组织和细胞中，miR-135b-5p的表达水平下降，上调miR-135b-5p表达可引起RBX1蛋白下调，显著抑制MM细胞的增殖、侵袭和迁移能力[14]。本研究发现，miR-135b-5p在两种RCC细胞系以及两种RCC细胞分泌EVs中均显著升高，提示miR-135b-5p也可能参与RCC的发生、发展。进一步研究miR-135b-5p参与RCC的分子机制后，笔者发现RCC细胞分泌富含miR-135b-5p EVs可以促进内皮细胞的成环作用。此外，通过文献调研和生物信息学分析，证实ANGPTL4是其重要靶点之一。qRT-PCR检测证实，过表达miR-135b-5p后的HUVEC细胞和HUVEC细胞分泌EVs中miR-135b-5p的表达水平显著升高。Western blot结果显示ANGPTL4蛋白的表达显著降低，且miR-135b-5p的过表达可使HUVEC成环作用增加，再次说明ANGPTL4是RCC进展中的关键靶蛋白，miR-135b-5p可进入HUVEC中发挥作用。目前，关于肿瘤患者血清中miR-135b-5p的表达变化和关于其他肾脏疾病(包括肾囊肿)血清中miR-135b-5p表达变化的报道尚缺乏。故而本研究针对RCC血清中miR-135b-5p表达变化进行研究，并深入研究其参与RCC发生、发展的分子机制。
血管生成是肿瘤发生和进展的关键病理过程。ANGPTL4是血管生成素家族一员，由C端纤维蛋白原样结构域和1个N端卷曲螺旋片段构成。既往研究表明，ANGPTL4在肿瘤血管生成过程中发挥了促血管生成作用[15]。2013年，一项研究通过使用HUVEC进行血管形成测定发现，过表达ANGPTL4的肿瘤细胞的条件培养基抑制了HUVEC的血管形成，并且评估血管形成的所有参数均被显著抑制，表明肿瘤来源的ANGPTL4的大部分抗血管生成活性是通过抑制肿瘤微环境中的血管形成来介导的[16]。综合以上研究证实，对于ANGPTL4的促血管生成和抗血管生成作用还存在许多争议，究其原因猜测可能与不同肿瘤组织及各自的肿瘤微环境等密切相关。此外，本研究发现ANGPTL4在转染miR-135b-5p的HUVEC中的表达明显下降，血管形成明显增加，说明miR-135b-5p的过表达可以抑制ANGPTL4的表达，从而促进血管生成。
本研究存在一定的局限性。首先血清miR-135b-5p检测的样本量偏少，缺乏良性疾病对照，且为单中心研究，后续研究中应加大样本量、多中心研究继续验证，并深入研究RCC血清EVs miR-135b-5p表达变化。其次，本实验对潜在靶基因的验证较为缺乏，后续将采用萤光素酶报告基因试验进一步验证；
最后，ANGPTL4作为miR-135b-5p的靶基因，参与RCC进展中血管形成的具体分子机制还需深入探究。综上所述，本研究发现miR-135b-5p在RCC患者血清中的表达水平升高，提示血清miR-135b-5p水平可作为RCC患者潜在的临床辅助分子筛查标志物。同时，体外细胞水平验证发现，miR-135b-5p在ACHN和Caki-1 RCC细胞系以及细胞分泌的EVs中表达水平显著升高。生物信息学分析结果表示，ANGPTL4作为miR-135b-5p的靶基因之一，参与了RCC发生、发展过程中的血管形成，对临床RCC的靶向分子治疗提供理论和实验依据。