2021—2022年我国8,株鸽新城疫病毒基因组特征
彭真奇，于晓慧，邢安琪，克军宏，李阳，蒋文明，刘朔，李金平，彭程，张富友，王桂军，王静静，刘华雷
（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；
2.安徽农业大学，安徽合肥 230036；
3.农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室（南方），山东青岛 266032；
4.宁夏大学，宁夏银川 750021；
5.塔里木大学，新疆阿拉尔 843300）
鸽新城疫俗称鸽瘟，是由新城疫病毒（NDV）引起鸽的一种急性、高度接触性传染病。NDV 在鸽群和鸡群引起相似的临床症状，以肠炎、严重腹泻等消化道症状和扭头歪脖、瘫痪等神经症状为主，传播迅速，并引起较高的发病率及死亡率，对养鸽业造成严重经济损失[1-2]。鸽NDV，也被称为鸽副黏病 毒I 型（pigeon paramyxovirus type I，PPMV-1），是NDV 的抗原变异株。NDV 在分离地位上属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）正禽腮腺炎病毒属（Orthoavulavirus）正禽腮腺炎病毒1 型（Avian orthoavulavirus 1）[3]。NDV 基因组为单股负链不分节段RNA，包含6 个结构基因，基因排列顺序为3"-NP-P-M-F-HN-L-5"，分别编码囊膜表面的融合蛋白（fusion，F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase，HN）以及与病毒聚合酶有关的核衣壳蛋白（nucleocapsidprotein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，L）和构成病毒囊膜表面支撑物的基质蛋白（matrix，M），此外P基因在转录时会产生2 个非结构蛋白——V 蛋白和W 蛋白[4-5]。NDV 毒力与F 蛋白的裂解位点密切相关[6]，但其毒力并不仅受F 蛋白裂解位点影响[7-8]，还与病毒复制复合物NP、P 和L 蛋白有一定关系[9-10]。NDV 虽然只有1 种血清型，但依据F基因编码区序列差异将其分为I 类（Class I）和II 类（Class II）两大类，其中I 类NDV 包含1个基因型3 个基因亚型，II 类NDV 至少分为21 个基因型（I—XXI），大部分基因型又可分为不同的基因亚型。基因VI 型NDV 可分为VI.1、VI.2.1、VI.2.1.2、VI.2.2.1、VI.2.2.2、VI.2.1.1.1、VI.2.1.1.2.1 以及VI.2.1.1.2.2 共8 个基因亚型[11]。
20 世纪70年代，Mars等[12]在德国首次报道了鸽群暴发新城疫。1985年，李德厚等[13]首次从我国鸽群中分离到基因VI 型NDV 强毒株。随后该毒株在我国鸽群广泛流行，目前已成为危害我国养鸽业主要病原之一。分子流行病学研究[14]表明，基因VI 型是在我国鸽群中流行的优势NDV基因型。受免疫选择压力以及RNA 病毒变异特性影响，NDV 变异速度加快，新亚型不断出现，鸽NDV 已显示出较明显的遗传多样性。2015年印度在鸽群中新分离到基因VI.2.1.1.2.1 亚型毒株[15]。我国先后报道了VI.2.1.1.2.2 亚型病毒和基因XX型毒株在鸽群中的流行[16-17]。国家新城疫参考实验室的长期监测数据显示，近年来我国鸽群的NDV检出率呈明显升高趋势[14]。因此，需要加强对鸽NDV 的监测和预警，深入分析流行毒株的分子特征，为研发基因VI 型新城疫疫苗提供依据。本研究对2021—2022年在国内部分地区筛选出的8 株鸽NDV 代表株进行全基因组测序和系统的基因组特征分析，以期进一步了解我国鸽NDV 的遗传进化特征，为综合防控鸽新城疫和疫苗研发提供参考依据。
1.1 毒株来源
从2021—2022年我国分离到的27株鸽NDV 中，筛选出8 株不同年份、不同地区代表株，分别为Pigeon/Anhui/2432/2021、Pigeon/Fujian/2168/2021、Pigeon/Fujian/1187/2021、Pigeon/Jiangxi/2027/2021、Pigeon/Yunnan/1078/2022、Pigeon/Ningxia/1111/2022、Pigeon/Guangxi/1228/2022 和Pigeon/Guangdong/2285/2022（表1）。8 株毒株由中国动物卫生与流行病学中心实验室从活禽市场采集的鸽口咽/泄殖腔拭子中分离、鉴定并保存。
表1 鸽NDV 代表株信息
1.2 主要试剂及材料
RNA 提取试剂盒，购自济凡生物科技（常州）有限公司；
RT-PCR 引物，由青岛睿博兴科生物技术有限公司合成；
RT-PCR 试剂盒One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，购自TaKaRa公司；
SPF 鸡胚，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。
1.3 病毒繁殖和纯化
将保存的鸽NDV 代表株，按照常规方法接种9～11 日龄SPF 鸡胚，弃18 h 内死亡鸡胚，96 h 后通过血凝（HA）试验鉴定收获的鸡胚尿囊液，鉴定结果为HA 阳性的尿囊液，-80 ℃保存备用。
病毒纯化使用有限稀释法：用PBS 将病毒进行10 倍倍比稀释，病毒尿囊液的不同稀释度分别接种3 枚SPF 鸡胚，每枚胚接0.2 mL 病毒液。收取上述试验结果中HA 阳性且最高稀释度的病毒尿囊液进行上述重复试验。纯化5 次后，收取病毒尿囊液作为种毒，-80 ℃保存备用。
1.4 核酸提取及RT-PCR 扩增
将上述收集保存的病毒尿囊液，参照济凡生物科技（常州）有限公司FineQuick 快速病毒DNA/RNA 柱式提取试剂盒说明书提取RNA；
利用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit 试剂盒及特异性引物[14]，扩增病毒基因组序列。RT-PCR 扩增程序：94 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min 45 s，35 个循环；
72 ℃延伸 5 min。利用SMARTer? RACE 5"/3" Kit（clontech）试剂盒测定基因组5" 和3" 末端序列[14]。测序工作由青岛睿博兴科生物技术有限公司完成。
1.5 基因组序列拼接与分析
使用Lasergene 软件将所测序列参考GenBank数据库中下载的基因VI 型NDV 基因组全长序列，进行编辑拼接和分析；
使用MEGA 6.0 软件，依据NDV F 和HN 蛋白功能区序列[18]，对8 株代表株的F 和HN 蛋白氨基酸关键位点的变异情况进行分析。
1.6 遗传进化分析
使用MEGA 6.0 软件，针对GenBank 数据库中下载的参考序列和8 株鸽NDV 代表株的F基因进行遗传进化分析，采用邻位相连法（neighbor-joining）构建遗传进化树，bootstrap 设为1 000 次重复。
1.7 基因重组分析
使用RDP4软件，通过GenConv、RDP、Chimaera、SiScan、LARD、MaxChi 等算法，对8株基因VI 型NDV 毒株全长序列进行重组分析。
2.1 基因组序列分析
8 株鸽NDV 代表株的基因组长度分析结果（表2）显示：8 株病毒基因组长度均为15 192 nt，按3"-NP-P-M-F-HN-L-5"的基因顺序排列；
分离株基因组3"和5"末端长度分别为55 和 114 nt，各基因的5"端非转录区（untranslated region，UTR）碱基数均高于3"UTR，除了F-HN 和HN-L 的基因间隔区（intergenic sequence，IGS）长度分别为31 和47 nt，其他基因之间IGS 长度均为1 nt；
8 株代表株的NP、P、M 和L 蛋白的长度分别为489、395、364 和2 204 aa，F 蛋白长度均为553 aa，与基因VI 型NDVF基因长度一致。
表2 鸽NDV 的基因组长度特征
8 株代表毒株的F 和HN 蛋白功能区氨基酸变异分析结果（表3）显示：F 蛋白裂解位点均为112RRQKR/F117，呈典型NDV 强毒特征；
与其他NDV 分子特征类似，有6 个潜在的N-糖基化位点（N-X-S/T）位于F 蛋白；
与100 株不同毒力毒株参考序列[18]的F 蛋白功能区对比，8 株毒株在F 蛋白融合肽（fusion peptide）、七肽重复区（heptad repeat region，HR）和跨膜区（transmembrane domain）均有多处氨基酸变异，其中GD2285/2022 株有8 个氨基酸变异，AH2432/2021株和FJ1187/2021 株各有7 个氨基酸变异，GX1228/2022 株有6 个氨基酸变异，FJ2168/2021 株、YN1078/2022株和NX1111/2022株各有5 个氨基酸变异，JX2027/2021 株有4 个氨基酸变异。除GD2285/2022 毒株的HN 蛋白长度为577 aa 外，其余病毒的HN 蛋白长度均为571 aa；
8 株代表株均具有5 个N-糖基化位点，分别为125（NNS）、347（NNT）、439（NKT）、487（NHT）、514（NIS），多个氨基酸变异存在于跨膜区。
表3 F 和HN 蛋白功能区氨基酸变异情况
HN 蛋白中和抗原表位氨基酸变异分析结果（表4）显示：8 株代表毒株HN 蛋白中和抗原表位均存在包含R197I、N263K、E347G、D349E、I514V 在内的至少5 个氨基酸变异，其中NX1111/2022 株和GX1228/2022 株共有6 个氨基酸变异，在5 个共同氨基酸变异的基础上，增加 了D569E；
AH2432/2021株和JX2027/2021 株共有7 个氨基酸变异，增加了I352V、D569G；
FJ2285/2021 株共有7 个氨基酸变异，增加了K321R 和D569E；
YN1078/2022 株共有7 个氨基酸变异，增加了R353Q 和D569E；
FJ2168/2021 株共有8 个氨基酸变异，增加了I352V、D569G 和K321E；
GD2285/2022 株有9 个氨基酸变异，增加了I352V、D569G、K/R333E 和K321E。
表4 HN 蛋白中和抗原表位氨基酸变异情况
2.2 遗传进化分析
使用MEGA 6 软件对8 株代表株的F基因序列和GenBank 数据库下载的参考序列构建遗传进化树。结果（图1）显示：我国基因VI 型分离株具有遗传多样性，其中4 株病毒属于基因VI.2.1.1.2.1 亚型，4 株病毒属于基因VI.2.1.1.2.2亚型。经MegAlign 软件对比，8 株病毒全长基因组的核苷酸同源性为91.9%～99.0%，其中NP基因核苷酸同源性为93.3%～98.8%，P基因为90.4%～98.3%，M基因为91.1%～99.2%，F基因为92.0%～98.9%，HN基因为91.5%～99.0%，L基因为93.1%～99.5%。4 株基因VI.2.1.1.2.1 亚型毒株间F基因核苷酸同源性为97.8%～98.9%，编码氨基酸同源性为97.8%～99.5%；
4 株基因VI.2.1.1.2.2 亚型毒株间F基因核苷酸同源性为96.3%～98.2%，编码氨基酸同源性为97.8%～98.9%。将8 株病毒F基因与近年来我国分离的基因VI 型毒株进行同源性比较发现，4 株基因VI.2.1.1.2.2 亚型毒株F基因与Yu[14]等分离的18 株VI.2.1.1.2.2 亚型NDV 的核苷酸同源性为95.7%～99.6%，与Wang等[19]分离的5 株VI.2.1.1.2.2 亚型NDV 的同源性为96.3%～98.7%；
4 株基因VI.2.1.1.2.1 亚型毒株F基因与Wang等[19]分离的1 株VI.2.1.1.2.1 亚型NDV 同源性为97.4%～98.9%。8 株鸽NDVF基因和HN基因与王静静等[20]从鸡群分离的5 株基因VII 型NDV 的核苷酸同源性分别为85.7%～88.1%和83.9%～87.3%。使用RDP4 软件对8 株鸽NDV基因组序列进行系统分析，并未发现基因重组（P＜0.05）。
图1 鸽NDV 分离株F 基因遗传进化树
新城疫是一种急性、烈性、高度接触性的传染病，给家禽养殖业的经济收入带来了冲击。NDV传播迅速，易感宿主广，已在世界范围内流行。鸽NDV 也被称为PPMV-1，是由传播到鸽体内的鸡源NDV 产生的变异株。鸽NDV 于20 世纪70年代在德国首次被发现，1977年传播到中东，随后迅速传播至欧美等各国，并导致第三次新城疫全球大流行。1985年鸽新城疫首次传入我国，随后在各地相继被报道，已严重阻碍了我国养鸽业的健康发展。2010—2012年Guo等[21]从我国4 个省份分离出的8 株鸽NDV，发现其均属于VI.2.1.1.2.2亚型；
2011—2013年Wang等[19]从我国6 个省份分离出6 株鸽NDV，发现其中5 株为VI.2.1.1.2.2亚型，1 株为VI.2.1.1.2.1 亚型；
2014—2021年罗瑶瑶等[22]与Yu等[14]从国内部分地区分离出28 株鸽NDV，发现其均属于VI.2.1.1.2.2亚型。由此可见，在过去的十年间，基因VI.2.1.1.2.2 亚型NDV 为我国鸽群中主要流行毒株。本研究对2021—2022年从国内部分地区鸽群分离到的8 株NDV 代表株进行基因组测序及遗传进化分析，发现4 株属于基因VI.2.1.1.2.1 亚型，4 株属于基因VI.2.1.1.2.2 亚型。上述研究均表明，近期流行的鸽NDV 具有遗传多样性，且基因VI.2.2.1.2.1 亚型分离株数量和分布省份也在不断增加，这可能与活禽跨省调运、部分活禽市场消毒措施落实不到位以及鸽群迁移等因素有关。
鸽NDV F 蛋白裂解位点与病毒毒力密切相关[14]。本次分离出的8 株鸽NDV 的F 蛋白裂解位点均为112RRQKR/F117，为典型的NDV 强毒株分子特征。8 株鸽NDV 全长基因组的核苷酸同源性较高，为91.9%～99.0%。与新城疫疫苗株La Sota等参考序列相比，8 株鸽NDV 在F 蛋白的七肽重复、区融合肽和跨膜区均有多处氨基酸变异，糖基化位点比较保守；
HN 蛋白糖基化位点半胱氨酸残基高度保守，其抗原中和表位中发生多个氨基酸变异。突变的产生可能是由于长期的疫苗免疫压力以及RNA 病毒的变异特性造成的，而抗原位点多处的氨基酸变异使其抗原性正逐渐发生变化，从而导致疫苗免疫失败。国家新城疫参考实验室的长期监测数据显示，近年来我国鸽NDV 流行率有升高的趋势[14]。其主要原因可能在于传统疫苗免疫效果不佳，且鸽新城疫尚缺乏抗原匹配性疫苗[23]。
鸽产业是我国第四大家禽产业，而影响养鸽业健康发展的重要疫病之一便是新城疫，因此要高度重视鸽新城疫防控，加强监测预警以及抗原匹配性疫苗研发，提高生物安全水平等综合性防控措施。
我国安徽、福建等7 个省份鸽群中流行的NDV 具有强毒分子特征，其F 蛋白七肽重复区、蛋白融合肽和跨膜区以及HN 中和抗原表位、蛋白跨膜区等功能区域存在多处氨基酸变异，且分属于2 个基因亚型，表明我国鸽NDV 具有遗传多样性。建议加强鸽NDV 监测，加快鸽新城疫抗原匹配性疫苗研发，以有效防控鸽新城疫流行。
猜你喜欢鸽群新城疫毒株鸽群即景小学生作文·小学中高年级适用(2022年2期)2022-07-07法国发现新冠新变异毒株IHU科学大观园(2022年2期)2022-01-23一起种鸽新城疫病因分析与防治家禽科学(2020年7期)2020-09-02一个鸽群飞过的黄昏文苑(2020年4期)2020-05-30商品化鸡新城疫活苗分类及特点家禽科学(2019年2期)2019-06-11猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株流行现状中国猪业(2017年11期)2017-12-11鸽群与鸽哨学与玩(2017年12期)2017-02-16鸭新城疫研究概况湖南畜牧兽医(2016年1期)2016-06-05鸡新城疫流行现状调查及防控对策河南畜牧兽医(2015年10期)2015-11-28鸡新城疫的临床症状畜牧兽医科技信息(2015年9期)2015-02-23