结直肠癌组织CALM1基因表达改变、EGFR突变情况及其临床意义
张磊 邵峰 李丽军 杜章
结直肠癌是常见的胃肠道恶性肿瘤，也是肿瘤界的防治重点[1]。目前手术切除仍是治疗结直肠癌的首要选择，但如何降低术后死亡率以改善预后仍是临床研究的重点。钙调蛋白1（calmodulin 1，CALM1）是CALM 家族的一种钙调蛋白，研究报道CALM1 能促进食管癌发展[2]，但其在结直肠癌中的表达及作用机制尚少有文献报道。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一个蛋白受体酪氨酸激酶，EGFR 突变可导致基因活性异常而参与疾病发生，研究发现EGFR 突变与非小细胞肺癌的发生及预后紧密相关[3]，但其在结直肠癌中的突变情况及对预后的影响还需进一步探讨。本次研究探讨结直肠癌患者癌组织CALM1 基因表达水平和EGFR 突变情况及其与预后的关系，以期为临床改善结直肠癌的预后提供参考。现报道如下。
1.1 一般资料 选择2017 年2 月至2018 年11 月期间在东阳市人民医院住院治疗的结直肠癌患者100 例作为研究对象，其中男性57 例、女性43 例；
年龄41～89 岁，平均（65.16±11.82）岁；
肿瘤部位：结肠癌52 例、直肠癌48 例；
最大肿瘤直径：≤5 cm 46 例，＞5 cm 54 例；
淋巴结转移53 例、未转移47 例；
Dukes 分 期：A 期20 例、B 期28 例、C 期52 例；
高分化32 例、中分化48 例、低分化20 例。纳入标准包括：①均接受手术治疗且经术后病理检查确诊的原发性结直肠癌；
②术前均未接受放疗、化疗。排除：①严重心肝肾功能损伤者；
②其他恶性肿瘤病史或其他结直肠疾病者；
③严重精神疾病者；
④高血压等慢性病史者；
⑤凝血功能或认知功能障碍者；
⑥既往有腹部手术史者；
⑦妊娠或哺乳妇女；
⑧病灶广泛侵袭邻近组织无法切除者；
⑨存在自身免疫性及感染性疾病者；
⑩失访患者；
○1因其他疾病、意外等死亡的患者。本次研究经医院伦理委员会审批，患者或家属均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 CALM1 基因表达水平检测 收集患者手术切除癌组织和切缘正常组织标本，按TRIzol 裂解抽提法提取总RNA，检测RNA 完整性，确定符合逆转录标准，根据CALM1-RNA 逆转录试剂盒进行逆转录，条件：37 ℃30 min，98 ℃5 min，-20 ℃保存。应用CALM1-RNA逆转录试剂盒对基因特异性引物进行实时荧光定量聚合酶链式反应扩增，条件：95 ℃1 min，60 ℃1 min，75 ℃5 min，共35 个循环，所有试验均至少重复3 次，采用2-△△Ct方法计算。本次研究以结直肠癌患者癌组织CALM1 基因平均表达水平作为分界线，将CALM1 基因≥平均表达水平记为高表达，＜平均表达水平记为低表达。
1.2.2 EGFR 突变检测方法 将收集的癌组织及切缘正常组织放入液氮中研磨成粉，取50 mg 置入2 ml 离心管，用DNA 提取试剂盒提取DNA，采用ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪检测EGFR 基因18～21 外显子的共29 种突变类型，分析EGFR 突变情况，所有操作均严格按照试剂盒说明书。
1.2.3 跟踪随访 所有患者术后均跟踪随访3 年，通过电话、门诊复查等方式随访患者生存情况，并进行生存分析。
1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0 软件进行统计学检验。计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验；
计数资料比较采用χ2检验；
CALM1 基因表达水平及EGFR 突变情况总生存率采用Kaplan-Meier法计算，绘制生存曲线并应用Log-rank检验比较组间生存差异。设P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 结直肠癌癌组织和切缘正常组织CALM1 基因表达水平及EGFR突变情况比较见表1
表1 癌组织和切缘正常组织CALM1基因表达及EGFR突变情况比较
由表1 可见，结直肠癌癌组织CALM1 基因表达水平及EGFR 突变型比例高于切缘正常组织，差异均有统计学意义（t=28.09，χ2=17.36，P均＜0.05）。
2.2 不同临床病理特征患者癌组织CALM1 基因表达水平及EGFR突变情况比较见表2
由表2 可见，不同性别、年龄、肿瘤部位、最大肿瘤直径患者CALM1 基因高表达、EGFR 突变型比例比较，差异均无统计学意义（χ2分别=0.44、0.26；
1.99、3.15；
2.62、2.67；
2.69、3.18，P均＞0.05）；
有淋巴结转移、Dukes 分期C 期、低分化程度患者CALM1基因高表达、EGFR 突变型占比高于无淋巴结转移、Dukes 分期A～B 期、高/中分化程度患者，差异均有统计学意义（χ2分别=11.79、7.70；
7.96、6.18；
7.30、8.24，P均＜0.05）。
表2 不同临床病理特征患者癌组织CALM1基因表达水平及EGFR突变情况比较
2.3 随访期间，100 例结直肠癌患者中病死35 例，余65 例患者均存活，3年病死率为35.00%。
2.4 CALM1 基因高表达与低表达生存曲线和EGFR突变型与野生型生存曲线见图1、图2
图1 CALM1基因高表达与低表达患者生存曲线
图2 EGFR突变型与野生型患者生存曲线
由图1、2 可见，CALM1 基因高表达和EGFR 突变型患者与CALM1 基因低表达和EGFR 野生型患者3年生存率（45.83%、42.42%vs82.69%、76.12%）比较，差异均有统计学意义（χ2分别=14.85、13.27，P均＜0.05）。
结直肠癌是生物学上高度异质性肿瘤，具有较高的发病率和病死率[4]。本次研究发现100 例结直肠癌患者3 年病死率为35.00%，略低于张微微等[5]研究报道的37.76%，可能与纳入样本量略有差异有关，但均可证实结直肠癌术后病死率较高。因此，探索影响结直肠癌患者手术预后的因素对临床积极干预以提高生存率尤为重要。
CALM1 是CALM 家族的钙结合受体蛋白，其表达水平与多种癌症相关，参与癌细胞增殖和转移，在肿瘤发生中起到一定作用，研究发现CALM 家族基因在口腔癌中普遍表达[6]。EGFR 是受体蛋白酪氨酸激酶，在肿瘤细胞中分布广泛，与特异性配体结合后，通过激活酪氨酸蛋白激酶途径，参与肿瘤细胞增长、迁移、复发等过程[7]。本次研究发现癌组织CALM1 基因表达水平和EGFR 突变型比例均高于切缘正常组织，与韩秀娟等[8]和李美玲等[9]研究一致，均表明CALM1 基因表达上调和EGFR 突变参与肿瘤发生。另本次研究发现有淋巴结转移、Dukes分期C 期、低分化程度患者CALM1 基因高表达、EGFR 突变型比例高于无淋巴结转移、Dukes 分期A～B 期、高/中分化程度患者，提示CALM1 基因表达水平和EGFR 突变与结直肠癌患者的临床病理特征关系密切，可能对结直肠癌病情和预后具有评估价值。
本次研究还发现CALM1 基因高表达、EGFR 突变型患者3 年生存率低于低表达、野生型患者，提示CALM1 基因表达水平和EGFR 突变与结直肠癌患者的生存情况密切相关。CALM 家族基因分别存在于不同的染色体上，但其蛋白质产物是完全相同的，钙调蛋白系统均可参与癌组织和正常组织的生长和增殖。研究显示CALM 家族成员基因表达上调与胰腺癌[10]、垂体腺瘤[11]等多种癌症有关，并且可通过多种途径促进肿瘤的转移和侵害，可根据其基因表达情况判断患者生存情况。故在结直肠癌中CALM1 基因表达上调可促进癌细胞侵袭和转移，增加患者预后不良和死亡风险。EGFR 是一种跨模型生长因子受体，可将肿瘤生长信号分子从细胞传递到细胞内，EGFR 突变会引起受体激活，导致机体正常组织细胞生物学特性改变，促进肿瘤细胞侵袭和增长，延缓肿瘤细胞凋亡，影响预后[12]。由此可见CALM1 基因高表达、EGFR 突变型在结直肠癌的发生发展中起到协同作用，可共同促进肿瘤的发生，影响患者预后效果。临床可通过早期检测CALM1基因高表达和EGFR 突变型鉴别诊断结直肠癌患者病情，有利于进一步延长患者生存期，提高患者生存质量。
综上所述，结直肠癌癌组织CALM1基因表达水平及EGFR 突变型占比高于切缘正常组织，二者均与患者临床病理特征和术后生存情况有关。本次研究不足之处在于样本选取量较少，不足以代表全国患者的特点，需在今后研究中扩大样本量，进行更广泛的探索。
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