癫痫患者外周血CD69、miR-130b-3p表达水平及其临床意义
赵锦华，杨霖崧，吴亚欣，贾丽娟，李文强，惠宇航
咸阳市第一人民医院神经内科，陕西咸阳 712000
癫痫是由各种原因导致的大脑神经元异常放电，是一种临时性、突发性脑功能紊乱的临床综合征，严重影响患者的生活质量和生命安全[1-2]。癫痫发病机制复杂，目前病因尚未完全明确，探讨与癫痫发作相关的基因或蛋白的表达有积极意义。CD69在急性病变，如脑血管损伤、心肌梗死、大手术等严重创伤中会导致外周血淋巴细胞亚群活性发生改变，即外周血T细胞的CD69表达上调[3]。研究显示，CD69与缺血性脑卒中后的脑损伤有关[4]。微小核糖核酸(miRNA)是一类内源性非编码RNA，多种miRNA参与神经元坏死、异常通路形成及神经胶质细胞增生等病理过程，从而调节皮质发育及脑功能，在癫痫的发生及调控中起重要作用[5-6]。有研究显示，精神分裂症患者miR-130b表达上调，且在治疗后其表达降低[7]。但关于CD69、miR-130b-3p在癫痫方面的研究相对较少，因此，本研究通过检测癫痫患者外周血CD69、miR-130b-3p表达水平，探讨二者与癫痫发生、发展的关系。
1.1一般资料 选取2018年2月至2019年2月本院神经内科收治的95例癫痫患者作为癫痫组。(1)纳入标准：①符合《临床诊疗指南：癫痫病分册》[8]癫痫诊断标准，均采用一线抗癫痫药物单药或多药联合治疗患者；
②根据患者家族史、脑电图、体格检查等确诊患者。(2)排除标准：①既往有脑外伤史、手术史患者；
②伴有神经及其他系统疾病患者；
③合并听力、视力障碍及失语等患者；
④近期服用过抗焦虑、抗抑郁药物或其他影响认知功能药物的患者。95例患者中男55例，女40例；
年龄28～47岁；
癫痫的发作类型：局灶性发作34例，全面性发作24例，全面性发作合并局灶性发作30例，不明类型7例。根据病情严重程度将癫痫患者分为轻度(2个月发作1次或更少)31例，中度(1个月发作<4次，但2个月发作>1次)22例，重度(1个月发作≥4次)42例。另选取同期来本院进行健康体检的健康者60例作为对照组，其中男33例，女27例；
年龄27～48岁。癫痫组与对照组的性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。所有研究对象均自愿加入本研究，并签署知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会审核通过。
表1 两组一般资料比较[n(%)或
组别n病程<1年1～<3年3～<6年≥6年居住地城市农村对照组60----35(58.33)25(41.67)癫痫组9529(30.53)19(20.00)25(26.32)22(23.16)53(55.79)42(44.21)χ2/t-0.097P-0.755
1.2仪器与试剂 库尔特Epics XL型流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；
实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪购自济南千司生物技术有限公司。TRIzol试剂购自Invitrogen公司；
反转录试剂盒(货号J6547M)、qRT-PCR试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；
miR-130b-3p、U6引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3方法
1.3.1标本采集 采集癫痫患者在发作后24 h及对照者健康体检时的空腹外周静脉血4 mL，分为2份，1份置于抗凝管中，用于检测外周血CD69表达水平；
另1份室温放置2 h自然凝固，4 ℃及12 000 r/min条件下，离心15 min，取上层血清分装至无菌离心管，标记后-80 ℃冰箱冻存，用于检测miR-130b-3p表达水平。
1.3.2流式细胞仪检测外周血CD69表达水平 在对照管和检测管中加入100 μL乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)抗凝全血，同时加入20 μL法国产荧光标记单抗IgG2a-PE及P-gp-PE，使其混合均匀，进行15 min的避光染色，采用同型IgG作为阴性对照，在Q-Prep标本制备仪上自动溶血、固定，调整好流式细胞仪光路后检测标本。计数104以上个细胞。
1.3.3qRT-PCR检测外周血miR-130b-3p表达水平 采用TRIzol试剂提取所有研究对象外周血中的总RNA，并以反转录试剂盒中的方法将其反转录为cDNA，进行qRT-PCR，每份标本重复3次。反应条件：94 ℃ 15 s；
60 ℃ 30 s；
70 ℃ 10 s；
39个循环。以U6作为内参基因，反应结束后确认qRT-PCR的扩增曲线和溶解曲线，采用2-ΔΔCt法计算miR-130b-3p的相对表达量。引物序列见表2。
表2 qRT-PCR引物序列
2.1两组外周血CD69、miR-130b-3p表达水平比较 与对照组比较，癫痫组外周血CD69、miR-130b-3p表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 两组外周血CD69、miR-130b-3p表达水平比较
2.2不同严重程度癫痫患者外周血CD69、miR-130b-3p表达水平比较 与轻度患者比较，中度、重度患者外周血CD69、miR-130b-3p表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
与中度患者比较，重度患者外周血CD69、miR-130b-3p表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。
2.3癫痫患者外周血CD69与miR-130b-3p表达水平的相关性 Pearson相关分析结果显示，癫痫患者外周血CD69与miR-130b-3p表达水平呈正相关(r=0.546，P<0.05)。
表4 不同严重程度癫痫患者外周血CD69、miR-130b-3p表达水平比较
2.4Logistic回归分析癫痫发生的影响因素 将是否发生癫痫作为因变量(是=1，否=0)，排除年龄等混杂因素后，以外周血CD69、miR-130b-3p表达水平作为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示，外周血CD69、miR-130b-3p表达水平升高是癫痫发生的危险因素(P<0.05)。见表5。
表5 Logistic回归分析癫痫发生的影响因素
癫痫是临床上比较常见的中枢神经系统疾病，临床表现以反复性、短暂性、发作性的中枢神经系统功能紊乱最为突出。相关研究显示，世界总人口中5‰～7‰的人群受癫痫疾病的折磨，部分癫痫患者需要使用抗癫痫药物进行长期治疗以控制病情，抗癫痫药物的使用可对患者神经系统和胃功能造成一定影响，从而影响癫痫患者的生活质量，且近年来癫痫的发病率呈现明显的上升趋势[9-11]。
CD69是T细胞活化后最早表达的抗原，当其表达后可作为辅助刺激分子，使细胞进一步活化和增殖，属于自然杀伤(NK)细胞信号传递复合体基因家族的一员，在活化的NK细胞及T细胞表面均可表达，在未活化的NK细胞及T细胞上均不表达，故CD69可作为一种活化诱导分子来反映细胞的活化状态。此外，CD69也是NK细胞杀伤活化性受体之一，其可以传递活化信号，反映NK细胞的杀伤功能和活化状态，在NK细胞没有杀伤功能时，CD69表达缺失[12]。杨立利等[13]研究结果表明，急性脊髓损伤患者CD69水平明显高于健康对照者，表明外周血淋巴细胞对急性脊髓损伤的刺激产生了积极的免疫应答。本研究结果表明，癫痫组外周血CD69表达水平高于对照组(P<0.05)；
与轻度患者比较，中度和重度患者外周血CD69表达水平升高，与中度患者比较，重度患者外周血CD69表达水平升高，提示CD69水平升高可能与癫痫的严重程度有关。此外，Logistic回归分析结果表明，外周血CD69表达水平升高是癫痫发生的危险因素，进一步提示CD69可能在癫痫病情进展中发挥一定作用。
miRNA参与调节免疫反应、神经元可塑性，且miRNA转录后处理参与了神经系统的生理学过程及信号通路的基因表达调控[14]。目前研究认为，血清miRNA主要从患者组织细胞中主动分泌进入血液循环，血清miRNA表达水平可反映病变组织内的情况[15]。HU等[16]研究发现，大鼠癫痫模型中大脑组织与外周血中的miRNA-34a、miRNA-22、miRNA-125a、miRNA-21表达水平均升高。本研究发现，癫痫组外周血miR-130b-3p表达水平高于对照组(P<0.05)，且随着癫痫患者病情严重程度加重，外周血miR-130b-3p表达水平不断升高，提示miR-130b-3p表达水平上调可能参与癫痫的发生及疾病进展。本研究中Logistic回归分析发现，外周血miR-130b-3p表达水平升高是癫痫发生的危险因素，提示检测miR-130b-3p表达水平可能对评估癫痫发生有积极意义。此外，Pearson相关分析结果显示，癫痫患者外周血CD69与miR-130b-3p表达水平呈正相关(P<0.05)，提示CD69、miR-130b-3p表达可能共同参与疾病发展，检测二者表达水平对于评估癫痫患者病情具有一定的参考价值。
综上所述，癫痫患者外周血中CD69、miR-130b-3p呈高表达，检测CD69、miR-130b-3p表达水平可能对评估癫痫患者病情严重程度有帮助。
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