绿色木霉pH响应因子编码基因TvPacC的功能分析及应用
张豪， 李哲， 郑泽慧， 王庆玲
(齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所， 济南 250014)
木霉(Trichodermaspp.)属于半知菌类的丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、木霉属，广泛分布于自然界中，是土壤微生物群落的重要组成部分[1-3]。木霉是重要的微生物蛋白酶来源，许多研究证明木霉具有复杂的胞外蛋白水解酶类系统，并且培养条件的不同可影响胞外蛋白酶的种类及组成[4]。木霉胞外蛋白酶多为丝氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶，可以降解酪蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、胶原蛋白、线虫体壁等多种蛋白类底物，且没有专一的底物酶切位点[4]。碱性蛋白酶(alkaline protease)属于丝氨酸胞外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子，具有较强的分解蛋白质的能力，可用于工农业废弃物的降解利用，也在木霉与其他病原菌的相互作用中起着重要作用[4]。同时，木霉蛋白酶所具有的良好生化特性也使其在工业领域得到青睐，其碱性蛋白酶在食品加工、洗涤等领域有广泛的应用。
微生物酶的产生受包括pH、碳源、温度等参数的影响。其中pH是改变代谢途径、影响工业酶生产和酶合成效率的主要因素[5]。研究表明，pH<5时，里氏木霉(Trichodermareesei)能够分泌酸性天冬氨酸蛋白酶；
当pH控制在6.0及以上时，里氏木霉(Trichodermareesei)则能够分泌一种类似胰蛋白酶的碱性丝氨酸蛋白酶。自然界中，真菌所处环境的pH一直处于不断变化之中，这种改变对真菌的生长、发育、次生代谢等生理活动具有非常重要的影响[6]。为了生存和繁衍，真菌进化出一种信号转导途径来响应外界pH的变化，这一过程使得微生物能够适应外界酸碱环境的变化，保证真菌的正常生长[7]。
前人在许多真菌中发现存在一条比较保守的pH响应信号途径，即Pal途径，包括PacC基因和Pal基因，其中PacC是该途径中的关键调节因子[8]。Pal途径由碱性pH信号激活，经过一系列传递，最终作用于PacC/Riml01转录因子。PacC是Pal途径中至关重要的组成部分，也是真菌适应酸碱环境的一个中枢性调控因子，其表达受酸性条件的抑制，而受盐碱条件的诱导[8]。PacC编码了一个与pH相关的转录调控蛋白，在碱性条件下，PacC调节了碱性基因的转录，并在Pal基因产物介导的信号存在下抑制酸性表达基因的转录[9]。在黑曲霉(Aspergillusniger)[9]、棕曲霉(Aspergillusochraceus)[10]、金毛青霉(Penicilliumchrysogenum)[11]、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)[12]等菌株中已鉴定出PacC基因。
研究发现，PacC基因对真菌适应高pH环境具有重要作用，真菌中许多有关盐胁迫和金属毒性响应相关基因的表达也受到PacC转录因子的调节。在不同真菌中，PacC/Rim101能够调节多种胞外分泌酶的产生，如蛋白酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶等。玉米黑粉菌(U.maydis)rim101敲除菌株所分泌的蛋白酶明显比野生型和回补菌株减少[8]；
在绿僵菌(M.robertsii)中MrPacC基因缺失对蛋白酶产生没有影响，但是会导致几丁质酶活力和编码基因表达量下降[8]；
盾壳菌(C.minitans)CmPacC缺失菌株的几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶的活力都明显降低[8]；
在稻瘟病(M.oryzae)中MoPacC基因缺失导致多种分泌型糖类降解酶的酶活力明显下降，包括多聚半乳糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-1,3-葡聚糖酶等[8]。
在不同木霉菌株中，PacC基因也对木霉的生长、水解酶的产生和基因表达起着重要的调节作用。在哈茨木霉(Trichodermaharzianum)中，ThPacC表达量随pH升高而增加，可调节几丁质酶、蛋白酶、葡萄糖渗透酶、细胞壁蛋白的表达[12]；
在里氏木霉(Trichodermareesei)中，随着pH的提高，TrPacC的表达量增加，并促进碱性基因表达，同时抑制酸性基因表达[13]。绿色木霉是各种蛋白酶的有效生产者，是现代工业发酵生产线上不可缺少的“生物机器”。研究发现，酸碱环境的变化对其蛋白酶分泌也有着重要影响，解析绿色木霉蛋白酶的合成途径与基因表达调控方式，挖掘绿色木霉产蛋白酶的调控系统及代谢网络极其重要。
为此，针对绿色木霉pH响应因子编码基因TvPacC进行功能鉴定，并通过构建TvPacC基因敲除工程菌株来开展其在绿色木霉碱性环境适应能力和产碱性蛋白酶能力等方面的应用研究，旨在为解析木霉响应碱性环境的分子机制及推进木霉在产碱性蛋白酶中的应用提供一定的理论和实践基础。
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511为本实验室筛选鉴定的一株具有良好生物质降解能力的木霉菌株，其在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC No.16800。
1.1.2 培养基
LB(Luria-Bertani)培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基等购自青岛海博公司。
基本培养基(minimal medium， MM)：1 L ddH2O, + 15 g KH2PO4, + 5 g (NH4)2SO4, + 0.6 g MgSO4(或1.23 g MgSO4.7H2O), + 0.6 g CaCl2(或0.8 g CaCl2·2H2O) + 0.005 g FeSO4·7H2O + 0.001 6 g MnSO4·H2O + 0.001 4 g ZnSO4·7H2O + 0.003 7 g CoCl2·6H2O(或0.002 g CoCl2) + 20 g葡萄糖。
1.1.3 试剂
大肠杆菌DH5α、T4连接酶试剂盒、高保真Taq酶等购自南京诺唯赞公司；
氨苄、潮霉素B和溶菌酶购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 不同pH条件下绿色木霉菌株pH响应因子TvPacC转录表达水平及产蛋白酶水平的测定
将200 μL木霉出发菌株Tv-1511的孢子分别接种于MM液体培养基中，28 ℃，180 r/min培养 48 h，通过2层无菌纱布过滤获得无菌的菌丝体。将等量的菌丝体分别接种于不同pH(pH=5、7、9)的含有2%脱脂奶粉的MM 液体无氮源培养基中，28 ℃，180 r/min培养72 h，分别收集菌丝体和发酵液。
菌丝体液氮研磨，利用Trizol法提取总RNA并制备cDNA，利用引物(TvPacC-qPCR-F: GATACTC-TGGCGGAATGC；
TvPacC-qPCR-R: ATCCTTGCGAA-TGCGATT)，采用荧光定量PCR的方法检测TvPacC的转录表达。回收的液体发酵液经 10 000 r/min 离心后取上清，制备粗酶提取液，利用福林酚法测定蛋白酶活性。
在PDA平板上活化木霉菌株，28 ℃避光培养48～72 h，使得木霉长势均一，再使用打孔器制备大小均一的菌块并分别接种于不同pH(pH=5、7、9)的含有2%脱脂奶粉的MM固体无氮源培养基(MM液体无氮源培养基+ 2% 琼脂)中，28 ℃静置培养48 h，观察菌落直径和水解圈。
1.2.2 绿色木霉TvPacC基因缺失工程菌的构建
(1)敲除片段的构建。以绿色木霉Tv-1511基因组DNA为模板，扩增TvPacC基因的上游片段和下游片段。敲除片段扩增引物分别为：上游片段扩增引物TvPacC-UP-F：GATTCGGGCGTCTCGAGATA和TvPacC-up-R：
GAGAGCTACCTTACATCAATATGGCAAGAGGCGCTTTGGCGCA；
下游片段扩增引物TvPacC-DOWN-F：GGTACTATGGCTTAGATGGAATACCCGCACTGAGACGTTCATGGCATTT和TvPacC-down-R：TCACTGCATGGCGTCTCCTT。以线性化的pBARGPE1-Hygro质粒为模板，扩增潮霉素抗性基因(HygR)，扩增引物为：HygR-F: GAGAGCTACCTTACATCAATATGGC和HygR-R: GGTACTATGGCTTAGATGGAATACCC。
(2)原生质体制备。接种绿色木霉Tv-1511于PDA平板，28 ℃培养10 d后，产生大量新鲜分生孢子；
用10 mL生理盐水(0.9% NaCl，0.05% Tween-20)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液；
在玻璃纸覆盖的PDA平板上，取 200 μL 孢子悬液涂布，28 ℃避光培养24 h，使PDA平板上的孢子萌发；
配制溶解酶溶液：取0.15 g 溶解酶(Lysing enzyme，Sigma：L1412)溶于20 mL溶液I(1.2 mol/L D-sorbitol, 0.1 mol/L KH2PO4, pH 5.6)，0.2 μmol/L滤膜过滤除菌；
取出PDA平板，将长有菌丝的纤维膜取出并反向贴在含有3～4 mL 裂解液的平板上，于28 ℃、100 r/min条件下处理 100 min。在无菌超净台下将平板中的纤维膜取出，确保大部分菌丝体保留在平板中，在此过程中可以用溶液A冲洗显微膜上残留的菌丝块，利用枪头反复吹吸液体中的菌丝块200次以上，充分释放内部的原生质体；
用装有4层纱布的1.5 mL 管过滤上述混合液，保留下层滤液并进行4 ℃离心，2 000 r/min离心10 min，弃上清，保留底部的原生质体，加1 mL溶液A，再次离心，弃上清；
加1 mL 4 ℃预冷的溶液II (1 mol/L sorbitol, 50 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)，冰上得到原生质体；
用血球计数板观察计数，稀释原生质体至107个/mL。
(3)原生质体转化及突变子筛选。冰上放置 15 mL 离心管，分别加入200 μL原生质悬浮液、10 μL 纯化的PCR产物、50 μL PEG溶液(25% PEG600, 50 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)；
用枪头混匀，冰上放置20 min；
加 2 mL PEG溶液，轻轻混匀，常温下放置5 min；
加2 mL 溶液II，轻轻混匀；
加2 mL混合液涂布在覆盖层析纸的含1 mol/L蔗糖PDA平板上，层析纸预先剪成条形；
28 ℃避光培养 24 h；
将条形层析纸转导含抗生素的PDA平板上，28 ℃避光培养36 h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2 d。
利用获得的TvPacC缺失工程菌株，采用荧光定量PCR的方法检测TvPacC的转录表达，扩增引物为：TvPacC-qPCR-F: GATACTCTGGCGGAATGC和TvPacC-qPCR-R: ATCCTTGCGAATGCGATT；
利用蛋白质免疫印迹(WB)的方法，检测TvPacC的蛋白表达。
1.2.3 绿色木霉工程菌株Tv-1511-△TvPacC适应碱性胁迫环境能力的测定
(1)无菌孢子的收集。接种绿色木霉出发菌株及Tv-1511-△TvPacC工程菌(△表示染色体缺失)于PDA平板，28 ℃培养10 d后，产生大量新鲜分生孢子；
用10 mL生理盐水(0.9% NaCl，0.05% Tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液；
用30%的甘油悬浮，充分混匀，分装到1.5 mL离心管中，标记好名称和时间，-80 ℃冻存；
取1管孢子液进行活菌计数，确定孢子液的浓度。
(2)平板耐碱实验。先在PDA平板上活化木霉出发菌株(Wildtype)和Tv-1511-△TvPacC工程菌，28 ℃避光培养48～72 h，使得原始菌株和突变工程菌木霉长势均一，再使用打孔器制备大小均一的菌块并转移到pH 9的PDA平板。将接有菌块的平板置于28 ℃培养72 h后，测量菌落生长直径。
(3)液体摇瓶耐碱实验。将200 μL木霉出发菌株(Wildtype)和Tv-1511-△TvPacC工程菌的孢子分别接种于PDB液体培养基中，28 ℃，180 r/min培养48 h，通过2层无菌纱布过滤获得无菌的菌丝体。将等量的菌丝体分别接种于pH 9的PDB液体培养基中，28 ℃，180 r/min培养72 h，收集菌丝体，测定菌体生物量。
1.2.4 绿色木霉工程菌株Tv-1511-△TvPacC产碱性蛋白酶能力的测定
(1)平板水解圈实验。在MM固体平板上活化木霉出发菌株(Wildtype)和Tv-1511-△TvPacC工程菌，28 ℃避光培养48～72 h，使得原始菌株和突变工程菌木霉长势均一，再使用打孔器制备大小均一的菌块并转移到pH 9的含有2%脱脂奶粉的MM 液固体无氮源培养基平板中。将接有菌块的平板置于28 ℃培养72 h后，观察蛋白酶水解圈。
(2)液体发酵产蛋白酶酶实验。将200 μL木霉出发菌株(Wildtype)和Tv-1511-△TvPacC工程菌株的孢子分别接种于MM液体培养基中，28 ℃，180 r/min 培养48 h，通过2层无菌纱布过滤获得工程菌和原始菌株的菌丝体。将等量的菌丝体分别接种于pH 9的含有2%脱脂奶粉的MM 液体无氮源培养基中，28 ℃，180 r/min培养，进行蛋白酶的诱导，72 h后通过2层无菌纱布过滤菌丝体，回收液体发酵液。回收的液体发酵液经10 000 r/min离心后取上清，制备粗酶提取液，利用福林酚法测定蛋白酶活性。
2.1 不同pH条件下TvPacC基因转录水平及绿色木霉产蛋白酶水平的变化
从绿色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511基因组中鉴定出了编码pH响应信号Pal途径中的关键调节因子PacC 的编码基因TvPacC。通过前期对 Tv-1511 开展的全基因组测序和精细基因组图谱绘制工作(GenBank Accession No.VCEC00000000；
BioProject: PRJNA543939；
BioSample: SAMN11791795)，得到了TvPacC基因及其编码蛋白的详细信息。TvPacC(NCBI accession number MZ417538)基因的序列已提交到NCBI GeneBank数据库。TvPacC的氨基酸序列包含有3个Cys2His2锌指结构，能特异结合靶标基因启动子区域的 5′-GCCARG序列(图1)。
TvPacC基因的表达受酸性条件的抑制，受碱性条件的诱导，在碱性环境下，表达水平会提高。在不同pH条件下，经过荧光定量PCR的检测，结果显示：TvPacC基因在酸性条件(pH 5)下表达量低，而在碱性条件(pH 9)下TvPacC基因的转录表达显著提高(图2)。
图1 TvPacC蛋白-氨基酸序列结构域示意图Fig.1 Schematic diagram of amino acid sequence and domain of TvPacC
木霉产蛋白酶活性的检测结果发现：在碱性条件(pH 9)下，绿色木霉Tv-1511分泌的蛋白酶水解圈不明显[图3(a)]，其产碱性蛋白酶的活性极低[图3(b)]。表明在碱性条件下，绿色木霉Tv-1511出发菌株中碱性蛋白酶的合成受到抑制。
图2 不同pH条件下TvPacC基因的转录表达水平Fig.2 Transcriptional expression levels of TvPacC gene in Trichoderma viride Tv-1511 strain under different pH
图3 不同pH条件下绿色木霉蛋白酶水解圈及活性水平Fig.3 Protease hydrolysis circle and activity in Trichoderma viride Tv-1511 strain under different pH
2.2 绿色木霉TvPacC基因缺失的工程菌(Tv-1511-△TvPacC)的构建
如图4所示，利用融合PCR构建了TvPacC基因敲除片段，通过聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化法成功获得了8株敲除TvPacC基因的绿色木霉Tv-1511工程菌。
随后，利用荧光定量PCR检测工程菌中TvPacC的转录表达，并利用蛋白质免疫印迹法检测程菌中TvPacC的蛋白表达。结果显示，在碱性条件(pH 9)下，TvPacC缺失工程菌株中检测不到TvPacC 的转录表达[图5(a)]和蛋白表达[图5(b)]。
图4 TvPacC基因敲除片段的构建流程及验证Fig.4 Construction and verification of knockout fragment of TvPacC gene
2.3 敲除TvPacC基因提高了绿色木霉的碱性环境适应能力
面对外界环境不断变化的pH条件，真菌所具有的PacC信号通路可以帮助真菌积极响应外界环境的变化，以保证真菌的生长和生产。开展绿色木霉工程菌株Tv-1511-△TvPacC的平板耐碱实验和液体摇瓶耐碱实验，结果显示：在平板耐碱实验中，Tv-1511-△TvPacC工程菌更能适应高碱性环境(pH 9)，其菌落直径相比野生型菌株(Wildtype)显著增加[图6(a)]。在液体摇瓶耐碱实验中，在pH 9的碱性环境下，Tv-1511-△TvPacC工程菌的生物量比野生型菌株(Wildtype)显著提高了[图6(b)]。
图5 荧光定量PCR和Western blot鉴定 TvPacC基因缺失的木霉工程菌Fig.5 Identification of Trichoderma engineering strains deleting TvPacC gene by fluorescence quantitative PCR and Western blot
2.4 敲除TvPacC基因提高了绿色木霉产碱性蛋白酶的能力
PacC介导的信号通路能够对基因表达和酶分泌产生影响，有研究发现PacC基因可调节几丁质酶、蛋白酶、葡萄糖渗透酶、细胞壁蛋白等的表达。利用工程菌株Tv-1511-△TvPacC，进行了碱性环境下(pH 9)的蛋白酶水解圈实验和蛋白酶活性检测实验，结果显示：相比野生型菌株，敲出了TvPacC基因的绿色木霉工程菌株具有更强的分泌碱性蛋白酶的能力，其在pH 9的脱脂奶粉平板上的水解圈更加明显[图7(a)]，其发酵液中碱性蛋白酶的活力显著提高[图7(b)]。
图6 木霉工程菌耐碱能力的分析Fig.6 Analysis of alkaline tolerance of Trichoderma engineered strains
真菌在不断变化的环境中生存时，外界pH是一个重要的生长调控因素。在检测到外界pH发生变化时，都能通过一些细胞反应来平衡体内的环境，来适应在酸性或者碱性环境下的生存。在真菌中，Pal途径就是前人研究发现的一条响应外界环境pH变化的重要信号途径，而PacC是这条途径中的关键调节因子，真菌通过激活PacC来响应环境pH水平[14-18]。当真菌检测到外界环境pH值变化时，这种环境信息就会被细胞表面的蛋白传感器PalH感受到[19]，PalH会影响一种与其相互作用的蛋白PalF，使PalF在碱性pH[20]的作用下泛素化，然后进一步影响Pal途径中的关键调节因子PacC，并最终引起住转录调控[16,21-24]及一些酶的分泌。
图7 碱性条件(pH 9)下木霉工程菌产碱性 蛋白酶能力分析Fig.7 Analysis of alkaline protease activity in Trichoderma engineered strains under alkaline condition (pH 9)
Pal途径最先在黑曲霉(Aspergillusnidulans)中被鉴定，并被广泛研究[25]。目前对pH信号通路研究较为清晰的是构巢曲霉，其信号通路7个Pal基因，分别为pacC、palA、palB、palC、palF、palH和palI[26]。Pealva[5]等在丝状真菌中，也鉴定出了这条通路的7个成员PacC、PalA、PalB、PalC、PalF、PalH和PalI。另外，在构巢曲霉中还发现PacC分为PacC72，PacC53和 PacC27，其中PacC72位于细胞质中参与感知外界环境pH的变化，PacC27位于细胞核中，在中性或者碱性环境，参与调控酸碱性相关的基因的表达[27]。
Moreno-Mateoset等[28]研究发现，在哈茨木霉中几丁质酶、蛋白酶、葡萄糖渗透酶和细胞壁蛋白等几种物质的产生，受PacC基因的调控。在构巢曲菌(A.nidulans)中，几个编码纤维素分解酶的基因受Pal-PacC介导的pH信号调节[29]，PacC可调控细胞外酶编码基因xlnA和xlnB的表达[30]。野曲霉(Spergillusnidulans)在中性条件下具有酸性和碱性磷酸酶活性，而PacC突变体在保持碱性磷酸酶活性的同时却失去了酸性磷酸酶活性[31]。这表明PacC能促进酸性磷酸酶的产生，抑制碱性磷酸酶的产生[32]。鉴定到一种绿色木霉(Trichodermaviride)pH响应因子编码基因TvPacC及相应的蛋白，并构建了绿色木霉TvPacC基因敲除菌株 Tv-1511-△TvPacC，与野生型绿色木霉菌株相比，该工程菌具有更好的碱性环境耐受能力，以及更强的产碱性蛋白酶能力。
(1)以绿色木霉Tv-1511基因组DNA为模板，扩增TvPacC基因的上游片段和下游片段，利用敲除片段同源重组法构建了木霉工程菌株Tv-1511-△TvPacC。利用木霉工程菌株进行了TvPacC基因在绿色木霉碱性环境的适应能力和产碱性蛋白酶能力等方面的应用研究。与原始菌株相比，敲除TvPacC基因后，绿色木霉的碱性环境适应能力和产碱性蛋白酶的能力都得到了显著提高，表明TvPacC基因在绿色木霉应对环境pH变化和生物合成等方面起着重要作用。
(2)木霉是重要的微生物蛋白酶来源，木霉蛋白酶所具有的良好生化特性也使其在工业领域得到青睐，其碱性蛋白酶在食品加工、洗涤等领域有广泛的应用。pH是改变代谢途径、影响工业酶生产和酶合成效率的主要因素。对TvPacC基因的鉴定和功能解析，为木霉响应碱性环境的机制解析及推进木霉菌株在产碱性蛋白酶中应用提供了理论支持和实践基础。
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