当归挥发油的提取工艺优化及抗氧化性研究
郭田甜，房兆营，刘震远，张微，毕艳艳，孙艳，关永霞*
(1.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006；
2.鲁南制药集团股份有限公司 中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；
3.鲁南贝特制药有限公司，山东 临沂 276006)
当归属于伞形科植物，入肝、心、脾经，有补血活血、润肠通便等功效[1]。当归化学成分主要含有挥发油、有机酸类、多糖类、黄酮类等多种物质，而挥发油是当归主要功效成分之一，含量约为1%[2-3]。挥发油大多由小分子物质组成，容易被机体快速吸收，大部分挥发油类具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌驱虫及镇痛等方面的药理作用[4-5]。当前包含挥发油的中药材广泛，尤以伞形科[6]、唇形科[7]、菊科[8]、姜科[9]、芸香科[10]等科含量较为丰富。近年来，含挥发油类的中药材在保健、医疗、日用产品等方面的研究日益增多，展现出广阔的应用前景。
挥发油提取方法一般分为有机溶剂萃取法[11]、超临界萃取法[12]与水蒸气蒸馏法[13]等，前两种提取方法具有操作繁琐、成本高、环境污染严重等缺点，而水蒸气蒸馏法克服了以上问题，成为了提取方法研究热点。齐巧明等[14]用水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油并优化了提取工艺，结果表明该法挥发油提取率高，操作方法可行，工艺参数稳定。除此之外，大部分挥发油都具有抗氧化的药理作用，当机体内自由基含量过高时，对机体内的核酸、蛋白质等产生破坏，加速机体代谢、衰老，而挥发油能够有效清除体内自由基类物质，有益于维持身体健康[15]。目前，当归药材的研究主要集中在栽培种植和药理作用方面，但对当归挥发油的抗氧化性报道相对较少，所以此方面的研究与应用非常必要。
本文以水蒸气蒸馏法提取当归挥发油，以当归粒径、加水倍数、提取时间作为考察因素。在单因素试验的基础上，利用响应面法对提取工艺进行了优化，筛选出最佳工艺条件参数，并对所提取的挥发油进行了抗氧化研究，为日后当归挥发油大规模提取生产及中药材资源的综合开发利用提供了一定的理论依据。
1.1 试验材料
当归药材来源于鲁南厚普制药有限公司，经鲁南厚普制药有限公司质检中心高级工程师范建伟鉴定为正品，符合2020年版《中国药典(一部)》[16]来源规定；
无水乙醇(分析纯)，天津天力化学试剂有限公司；
抗坏血酸(纯度99%)，天津市科密欧化学试剂有限公司；
无水硫酸钠(分析纯)，重庆茂业化学试剂有限公司；
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析纯，美国Sigma-Aldrich生物技术公司。
1.2 试验仪器
S-10挥发油提取器，天津欧普化学仪器有限公司；
MS1003TS02型电子天平，梅特勒-托利多有限公司；
KM-1型可调控温电热套，鄄城华鲁电热仪器有限公司；
Ultimate 3000型高效液相色谱仪，北京赛默飞科技有限公司；
GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；
SPECORD 210 PLUS紫外分光光度计，江苏精诚仪器设备有限公司。
1.3 当归挥发油提取工艺优化
1.3.1 当归挥发油提取工艺
使用水蒸气蒸馏法，取当归粉碎后过筛，将400 g当归颗粒置于圆底烧瓶中，加自来水3～7倍加热回流，提取4～8 h后停止蒸馏，将药液静置冷却，待油水分离后收集挥发油。
1.3.2 单因素试验设计
经预试验确定将当归粒径、加水倍数、提取时间3个因素作为当归挥发油提取工艺的考察对象，结果表明当归粒径可取值范围为10～80 目，加水倍数可取值范围为当归质量的3～7倍，煎煮时间可取值范围为4～8 h，由此设计单因素试验：各组平行均称取400 g阴干后的当归，固定加水倍数5倍，煎煮时间6 h，分别考察10、24、50、65、80 目筛粉碎粒径对挥发油提取率的影响；
固定当归粒径50 目，煎煮时间6 h，分别考察3、4、5、6、7倍加水量对挥发油提取率的影响；
固定当归粒径50 目，加水倍数5倍，分别考察4、5、6、7、8 h煎煮时间对挥发油提取率的影响。
按2020年版《中国药典(四部)》[17]中挥发油测定甲法测定当归挥发油提取率，具体计算方法见式(1)。
(1)
式中，V为当归挥发油出油量，mL；
M为当归药材颗粒质量，g。
1.3.3 响应面优化试验设计
根据响应面试验设计原理和单因素试验结果以及生产实际需要，选取当归粒径(A)、加水倍数(B)、提取时间(C)等3个影响因素，以挥发油提取率作为响应值，各取3个水平，进行三因素三水平响应面优化试验，试验因素与水平见表1。
表1 试验因素水平与编码
1.4 当归挥发油抗氧化性的测定
参考罗秋水等的测定方法[18]，并作出略微修改。
1.4.1 DPPH自由基溶液的配制
精确称取6 mg DPPH标准品，置于100 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，配成0.06 mg/mL的DPPH标准品溶液，冷藏待用[19]。
1.4.2 当归挥发油样品溶液的配制
取适量的挥发油置于100 mL的容量瓶中，用无水乙醇将样品配制成质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的样品溶液。分别取2 mL以上样品溶液，置于离心管中，分别加入2 mL 0.06 mg/mL的DPPH标准品溶液，混匀后避光静置30 min，再用分光光度计分别测定混合溶液在517 nm处的吸光度，记为a1，用无水乙醇代替DPPH标准品溶液，517 nm处测定吸光度，记为a2，用无水乙醇代替样品溶液，相同条件下测定吸光度，记为a0，见式(2)。阳性对照采用与样品质量浓度相同的抗坏血酸(维生素C)对照品溶液。
DPPH自由基清除率=[1-(a1-a2)/a0]×100%。
(2)
1.5 数据分析
利用Design-Expert 10.0以及Excel 8.0软件对试验数据进行分析处理，每个样品3次重复，取平均值。
2.1 单因素试验结果
由图1可知，当归粒径24 目、加水倍数6倍、提取时间7 h时挥发油提取率均最高。当归粒径大于24目时，当归颗粒与水的接触面积较小，颗粒内部挥发油难以蒸出；
而粒径小于24 目时，粒径较小，接触面积过大，药材颗粒与水充分接触后内部含有的多糖、内酯类等小分子物质经水煎煮后极易被提取出来，导致水中的黏性物质增多，造成当归药材颗粒发生黏结、成团现象，不利于挥发油的蒸出，同时烧瓶底部还会有少量颗粒粘在瓶壁，出现焦糊现象，这也可能是挥发油量损失的原因之一。加水过多会使挥发油在水中部分溶解，而加水过少无法充分浸润当归药材；
提取时间缩短，颗粒内部的有效成分不能完全溶出，而时间过长提取率变化不大且会提高生产成本，耗时、费力。综上所述，各个因素的改变均会造成挥发油提取率的下降。因此，为了综合考量挥发油提取工艺参数，本试验结合单因素结果进行后续响应面分析。
图1 当归粒径、加水倍数、提取时间对挥发油提取率的影响Fig.1 Effects of the particle size of angelica granules, water addition factor,and extraction time on the extraction rate of volatile oil
2.2 响应面试验设计与结果
根据单因素试验结果，并考虑实际生产需要的条件。以当归粒径(A)、加水倍数(B)、提取时间(C)为自变量，以挥发油提取率为响应值设计试验，试验方案及结果见表2。采用Design Expert 10.0软件对试验数据进行二次响应面回归分析，得出当归挥发油提取率与各因变量的模拟方程为：
Y=0.55-0.006 625A+0.007 875B+0.015C-0.001 500AB-0.002 250AC+0.002 250BC-0.029A2-0.020B2-0.013C2。
表2 响应面试验方案及结果
表2(续)
2.3 回归模型显著性检验及方差分析
根据表3可知，回归模型P值<0.001，处在极显著水平，表明该模型显著回归，方程可以确切表明挥发油提取率与各因素之间的关系。表中多元相关系数R2=0.989 2，表明该回归方程具有极高的可信度；
失拟项P=0.061 9>0.05，表示极不显著，证明了该回归模型与试验拟合度极高。表中A2、B2、C2各项的P值都小于0.05，均对响应值结果影响显著。根据F值可以看出影响挥发油提取率的因素由大到小顺序为提取时间、加水倍数、当归粒径。
表3 回归模型显著性检验及方差分析
2.4 响应面及等高线分析
等高线图和响应面图可以直观地反应出各因素交互作用对挥发油提取率的影响，等高线中的圆形表示两因素交互作用不太明显，而椭圆形则表示两因素的交互作用比较明显[20-21]。如图2所示，提取时间与粒径两者的等高线图呈椭圆形，交互作用较为显著，而当归粒径与加水倍数、提取时间与加水倍数的等高线图均呈现出圆形，表明两者交互作用不显著。
图2 因素交互作用的响应面图和等高线图Fig.2 Contour diagram and response surface diagram of factor interaction
2.5 当归挥发油工艺验证
响应面法得出该模型最优解：当归粒径20.248目、加水倍数6.246 倍、提取时间7.757 h。根据药典规定并结合实际生产条件，将工艺条件修正为：当归粒径24目、加水倍数6 倍、提取时间7 h，在此条件下提取3批当归挥发油，见表4。结果表明了上述工艺参数条件准确可靠，具有实际生产价值。
表4 工艺验证实验结果
2.6 当归挥发油抗氧化性试验结果
由图3可知，当归挥发油从0.2 mg/mL增加到1.2 mg/mL时，DPPH自由基清除率从12.7%增加到51.9%，即挥发油抗氧化性对样品质量浓度有一定依赖性。图中可以发现，使用相同质量浓度的维生素C代替样品质量浓度时，DPPH自由基清除率高于当归挥发油，维生素C对DPPH自由基的清除率一直处于较高水平。结果表明了当归挥发油抗氧化能力比对照品维生素C差，当归挥发油的IC50为0.953 mg/mL。
图3 当归挥发油对DPPH自由基的清除作用Fig.3 DPPH free radical scavenging effect of A. sinensis volatile oil
为了有效提高当归药材的使用价值，本试验以当归药材为研究对象，利用响应面法对当归挥发油提取工艺进行优化。优选出的工艺参数如下：当归粉碎粒径24目，加水倍数6倍，提取时间7 h，在此条件下挥发油提取率可达到0.538%。然后，对该当归挥发油进行DPPH自由基的清除率研究，结果表明当归挥发油具有一定的抗氧化性，样品质量浓度在0.2 mg/mL～1.2 mg/mL范围内时，DPPH自由基清除率与当归挥发油的质量浓度呈显著的正比量效关系，当归挥发油质量浓度为1.2 mg/mL时，DPPH自由基清除率最高。此研究为当归药材的提取工艺摸索出最优条件，结果参数稳定、可行。本试验使用响应面法优化了当归挥发油的提取工艺并测定了其抗氧化活性，旨在为挥发油的进一步开发利用提供理论指导，为当归临床应用范围的扩展提供新的思路。
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