松材线虫传播与松墨天牛取食行为相关性研究
王 洋 ，王立超 ，喻爱林 ，金明霞 ，刘晓华
（1.江西省林业科学院，江西 南昌 330013；
2.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037）
松材线虫病（Pine wilt disease）是由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的一种毁灭性的森林病害，是当前世界上最具危险性和传染性的森林病害[1]。由于该病具有易传播、难防治、患病松树死亡快等特点，而被世界多国列为重要的检疫性病害。目前，该病害已侵入我国多个风景名胜区、重要生态功能区、以及东北地区。已经对我国部分地区自然景观、生态环境及松林资源造成严重破坏，给林业产业造成严重的经济损失，并对我国大面积林区及松林景观生态区域构成严重威胁。
松材线虫的传播需要借助媒介昆虫进行。松墨天牛（Monochamus alternatus）在东亚地区是最主要的松材线虫媒介昆虫[2-4]。松墨天牛成虫羽化后寻找健康松树进行取食补充营养，并在松树表皮造成伤口，其携带的扩散型松材线虫脱离后通过伤口进入树体，并脱皮转化为繁殖型成虫进而快速繁殖对松树造成危害[5,6]。
松墨天牛羽化后其携带的松材线虫并不能立即开始传播，而是需要经历一段时间后才开始脱离。Enda等认为4龄扩散型松材线虫幼虫在媒介天牛羽化后的第10天开始脱离[7]，Hosoda等认为在媒介天牛羽化后的3～5天后松材线虫开始脱离[8]，Aikawa等认为在媒介天牛羽化后的第7天其携带的松材线虫开始脱离[9]，Jikunaru等认为在媒介天牛羽化后的第5天松材线虫开始脱离[10]，Wang等认为松材线虫起始脱离媒介天牛的时间主要集中在其羽化后的7～12天[11]。虽然各研究结果不尽相同，但是都普遍认为媒介天牛羽化需经历一段时间后松材线虫才开始从媒介体内脱离。
针对何种原因触发导致了松材线虫从媒介昆虫的脱离，目前，虽有多种说法但是没有统一的定论。Stamps等认为扩散型松材线虫体内中性脂肪的降解跟松材线虫的脱离有密切关系，发现媒介天牛羽化后随着时间的延长，其体内携带的松材线虫体内的脂肪含量逐渐低，并认为松材线虫自身内在原因导致了松材线虫的脱离[12]。Ishkawa等在琼脂平板上测试萜烯类物质 （松树挥发物）对扩散型松材线虫的吸引，发现β-月桂烯 （βmyrcene）对离体的扩散型松材线虫具有很强的吸引力，认为松树挥发物的诱引是导致松材线虫脱离的原因[13]。Aikawa等用健康松树枝条和经过蒸煮后消除松树挥发物质的枝条分别喂养松墨天牛，结果认为松材线虫的脱离是自发性行为，松树挥发物反而在一定程度上抑制了线虫的脱离[14]，认为松材线虫的脱离可能是内源性因素造成的[12,14]。Wu等认为松墨天牛羽化后其呼吸作用会逐渐增强，同时其产生二氧化碳的速率也加快，当其气管内的CO2浓度升高达到一定临界值时，因松材线虫对CO2的趋避性最终导致线虫的脱离[15]。
松墨天牛成虫取食行为是其生命周期中重要的环节，也是松材线虫传播的关键阶段，松材线虫可通过天牛取食造成的伤口进入健康树体内完成传播[16,17]。但是，媒介天牛取食行为是否是触发导致松材线虫脱离的原因尚不明确。为了进一步研究媒介天牛携带的松材线虫的脱离原因，本研究中我们分析了媒介天牛（松墨天牛）取食行为对松材线虫脱离的影响，以及取食量与松材线虫传播比率的相关性，并分析了松树挥发物对松材线虫传播的影响。
1.1 松墨天牛幼虫获取与喂养
试验用枯死马尾松（Pinus massoniana）疫木，于2022年1月份收集于江西省梅岭国家级风景名胜区，木段需被松墨天牛幼虫侵染。将木段劈开，取出其中的松墨天牛幼虫共130头，并用人工饲料进行喂养，如图1所示。于25℃培养箱中培养至5龄幼虫，每隔10天更换1次饲料。
（1）饲料配方：蔗糖：25 g，酵母粉：15.625 g，琼脂：50 g，苯甲酸钠：2.5 g，山梨酸：1.25 g，0.5mol/LH2SO4：12.5mL，松树木屑：125 g，麦胚粉/大豆粉：25 g，胆固醇：1.875 g，抗坏血酸：5 g，干酪素（酪蛋白）：25 g，氯化胆碱：1.25 g，H2O：1000mL。
（2）饲料配制：松树木屑过孔径为1.0mm筛，于60℃干燥箱烘干。取不锈钢锅，加入1000mL双蒸水煮至沸腾后加入50 g琼脂，待琼脂完全融化后加入除松树木屑和H2SO4以外的所有组分，充分煮沸后，用H2SO4滴定调节饲料的pH，再加入木屑，充分搅拌；
并分装到图1小杯中（40mL），于105℃灭菌15min，冷却后保存于4℃冰箱。
图1 松墨天牛幼虫喂养Figure 1 Feeding of beetle larvae
1.2 携带松材线虫天牛培育
本试验所用松材线虫AMA3虫株由南京林业大学森林保护系森林病理实验室提供。
采集新鲜马尾松木段直径约5 cm，将木段截为10 cm长小木段，并接种松材线虫10000条，于25℃条件下抚育1个月。用钻头打1 cm×5 cm圆洞，将5龄松墨天牛幼虫（挑选健康个体120头）接种于圆洞中，用锡箔纸封口，并于25℃培养；
如图2所示；
直至松墨天牛成虫羽化。
图2 携带线虫天牛培养Figure 2 Culture of beetles carrying pine wood nematode
1.3 松墨天牛饲喂与松材线虫传播
及时收集新羽化的松墨天牛（每2～4 h观察羽化情况，正常羽化并用于试验个体共91头），将天牛分为两组，一组立即用健康新鲜马尾松枝条进行喂养，另一组饥饿处理4天后再进行喂养，喂养方法如图3所示,并每日更换新鲜枝条。
图3 天牛成虫喂养Figure 3 Feeding of adult beetles
天牛取食量：本研究以取食面积测算松墨天牛取食量，将天牛取食过的枝条留下的刻痕用刻度尺测量进行估算。天牛取食枝条如图4-A所示。
天牛传播线虫数量：将每日更换下的枝条剪碎（以及养虫瓶中碎屑）如图4-B，用贝尔曼漏斗法[18]进行分离，12小时后收集分离液并于显微镜下计数松材线虫数量：为单日松墨天牛传播线虫数量。首次分离到松材线虫的日期为天牛起始传播松材线虫的日期。松墨天牛死亡后用上述方法分离其体内残余松材线虫。松材线虫传播率=传播线虫总量/（传播总量+残余量）。
图4 天牛取食枝条处理Figure 4 Treatment of branches fed by beetles
1.4 数据分析
Spass 19.0用于数据分析。分析不同饲喂方法松材线虫起始脱离松墨天牛时间的差异性，以及松墨天牛取食量与传播线虫比率的相关性。
2.1 不同饲喂处理对线虫脱离影响
松材线虫起始脱离松墨天牛的时间情况如图5所示。羽化后立即喂养的松墨天牛共55头，平均起始传播线虫时间为8.16天；
经饥饿处理后喂养的天牛共36头，平均起始传播线虫时间为7.76天。对两种饲喂处理下天牛起始传播线虫时间进行差异性分析P=0.2，表明羽化后立即喂养和饥饿处理后再进行喂养的天牛，其携带的松材线虫起始脱离的日期无明显差异；
表明取食与否对松材线虫的脱离没有直接影响。
图5 松材线虫起始脱离天牛时间Figure 5 The start time of PWN departure from beetle
2.2 天牛取食量与传播线虫比率
本研究中，松墨天牛取食量与其传播松材线虫情况如表1所示。本研究中共有20头天牛正常死亡，可用于分析取食与传播线虫关联性。松材线虫传播平均比率为25.71。松墨天牛传播线虫期间平均取食量为8655.98mm2。对天牛取食量和松材线虫传播比率进行相关性分析，相关系数r=-0.19。表明媒介昆虫松墨天牛取食量大小与松材线虫传播比率呈现较弱的负相关性。
表1 天牛取食量与松材线虫传播Table 1 The feeding quantity of beetle and the transmission of pine wood nematode
媒介昆虫羽化后，松材线虫随媒介昆虫进行传播，取食阶段是媒介昆虫生命周期中重要的环节，也是松材线虫传播的关键阶段，松材线虫可通过天牛取食造成的伤口进入健康树体内完成传播[16,17]。本研究结果发现经饥饿处理的媒介天牛与正常喂养的天牛其松材线虫起始传播的时间无明显差异，表明松材线虫的脱离不是由媒介昆虫的取食行为触发的。同时饥饿处理的天牛未接受到松树挥发物的刺激，其携带的松材线虫也未接收到挥发物质的刺激，可以判断松树挥发物质也不是触发松材线虫脱离媒介昆虫的原因。Ishkawa在琼脂平板上测松树挥发物对扩散型松材线虫的吸引， 发现 β-月桂烯 （βmyrcene）对扩散型松材线虫具有很强的吸引力[13]，而Aikawa等用正常枝条和经过蒸煮后消除松树挥发物质的枝条分别喂养松墨天牛，结果认为松材线虫的脱离是自发性行为，松树挥发物反而在一定程度上抑制了线虫的脱离[14]，这可能表明松树挥发物仅对松材线虫脱离后的移动起到信号指引作用。
对媒介昆虫的不同饲喂处理，会导致媒介昆虫代谢发生差异，但这种差异并未导致传播线虫起始发生明显差异，表明媒介天牛羽化后代谢的变化也不是导致松材线虫脱离的触发机制。
本研究中媒介天牛取食量与松材线虫传播比率呈现弱的相关性，表明松材线虫传播数量的多少并非由媒介昆虫取食所决定。Wang等研究认为松材线虫的传播具有明显的规律性，而媒介天牛的取食量保持相对恒定[11]；
也表明松材线虫的传播与媒介天牛的取食关联性不大；
媒介天牛取食行为仅为松材线虫传播的一个重要途径，而非原因。
Stamps等认为松材线虫体内中性脂肪的降解跟其脱离媒介昆虫有密切关系，发现媒介天牛羽化后随着时间的延长，其携带的松材线虫体内的脂肪含量越来越低，认为松材线虫自身内在原因导致了松材线虫的脱离[12]，Aikawa等认为松树挥发物不是松材线虫脱离的原因，其脱离可能是内源性因素造成的[12,14]。同时研究认为松材线虫脱离媒介昆虫需要消耗能量克服天牛气管的阻力[19]，而能量产生需要消耗氧气；
天牛羽化后其呼吸作用逐渐增强[15]，这可能导致天牛气管中的线虫接受到充足氧气，降解其体内中性脂肪产生能量。
松材线虫脱离媒介原因推测：媒介天牛羽化后两个重要的行为是取食和呼吸。取食行为不是导致线虫脱离的原因，呼吸行为的增强可导致线虫产生充足的能量触发其具有脱离的能力；
天牛气管中氧气浓度变化差异对其移动方向起信号指引作用，媒介天牛取食行为仅是其传播的途径。