恩诺沙星与氟苯尼考对中华鳖组织损伤的联合毒性探究
张永刚，王 政，张凯璇，邢丽红，吴 薇，李 靖，武宁宁，宋以柱，刘 莹
(1.中国海洋大学化学化工学院，山东青岛 266100；
2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；
3.青岛市海洋发展促进中心，山东青岛 266071；
4.青岛市海洋管理保障中心，山东青岛 266071；
5.青岛市渔业技术推广站，山东青岛 266071)
由于环境中多种抗生素低剂量、长时间混合暴露的特点，单一抗生素的生物学效应研究显然不能满足对抗生素生态毒理效应的正确全面评估，因此对抗生素进行联合毒性研究势在必行。目前，关于恩诺沙星和氟苯尼考对甲壳类动物、海洋细菌、轮虫、海洋硅藻和鱼类的毒性，恩诺沙星与磺胺二甲嘧啶的联合毒性已有报道，但关于恩诺沙星和氟苯尼考的联合毒性，及对两栖动物(中华鳖)联合暴露造成的毒性研究较少。本研究使用恩诺沙星与氟苯尼考配制成抗菌剂混合物，对中华鳖进行了低、中、高浓度(相当于每种药物正常临床剂量的1、3、5 倍)的毒理学研究，以期为抗菌剂混合物在中华鳖病害防控及兽医临床中的科学使用提供理论依据。
1.实验动物 中华鳖由山东省平度百岁泊中华鳖养殖基地提供，体质量为(500±50)克/只。实验前需进行物理和生化检查，以确保所有实验鳖无病无伤，体内无恩诺沙星和氟苯尼考药物残留，于给药前停饲24小时。
2.药品与试剂 恩诺沙星原料粉(纯度≥98%，CAS：MFCD00792463)购自上海麦克林生化科技有限公司，氟苯尼考原料粉(纯度≥99%，CAS：73231-34-2)购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司，无水乙醇、甲醛、冰乙酸、二甲苯均为分析纯。
3.药物配制 参考2015年版《中国兽药典》《新编渔药手册》和《恩诺沙星水产养殖使用规范》(SC/T 1084-2007)用药标准，氟苯尼考与恩诺沙星对鱼的日推荐用药剂量均为15 毫克/千克，因两种药物联合使用，故每种药物用量减半。使用0.9%生理盐水将氟苯尼考原料粉与恩诺沙星原料粉分别配制成浓度为15、45、75毫克/毫升的药液，即鱼推荐剂量的1倍剂量(恩诺沙星7.5毫克/千克＋氟苯尼考7.5毫克/千克)、3倍剂量(恩诺沙星22.5 毫克/千克＋氟苯尼考22.5 毫克/千克)和5 倍剂量(恩诺沙星37.5 毫克/千克＋氟苯尼考37.5毫克/千克)(体质量计)。
4.实验设计 实验设3个实验组(1倍、3倍及5倍剂量组)和1个对照组，均设3个平行，每个平行实验鳖10 只。参照刘莹等(2022)的方法，实验组采用口灌给药方式，用带有橡皮软管的注射器从中华鳖口中插入，灌喂抗菌剂混合物(恩诺沙星和氟苯尼考)药液0.5 毫升。对照组口灌等量的无菌生理盐水溶液。实验共进行5 天，口灌1 次/天，实验期间水温为25～26℃。
5.样品采集与组织切片处理 参照刘莹等(2022)的方法，于停药24 小时后，在对照组和口灌不同剂量抗菌剂混合物实验组随机取3只中华鳖于冰盘上进行解剖，采集肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肌肉、肠道、睾丸和精巢组织样本。参考张永刚(2019)的方法，对所有组织进行固定、切片、染色后，在显微镜下进行病理学分析。
1.肠道组织结构观察 对照组肠黏膜结构清晰，黏膜细胞类型正常，肠绒毛结构完整(图1-肠道A)。与对照组相比，1 倍剂量组肠绒毛出现孔隙，结构不完整(图1-肠道B)。随着口灌剂量的增加，3倍剂量组肠固有层结构皱缩，肠绒毛排列不整齐，出现脱落现象，细胞核H.E.染色加深(图1-肠道C)；
5倍剂量组黏膜层相融，结构模糊，固有层、中央乳糜管消失，肠腔内可见大量脱落的肠黏膜(图1-肠道D)。
2.肝脏组织结构观察 对照组肝细胞排列紧密，肝小叶、中央静脉和汇管区结构正常(图1-肝脏A)。与对照组相比，1倍剂量组肝静脉血管壁增厚，中央静脉出现炎性细胞(图1-肝脏B)。随着口灌剂量的增加，3倍剂量组可见肝血窦扩张，有大量血细胞浸润(图1-肝脏C)；
5 倍剂量组肝细胞结构松散，肝静脉血管壁继续膨胀，血窦继续扩张，窦壁破碎细胞散布于其中(图1-肝脏D)。
3.肾脏组织结构观察 对照组肾小球和肾小管清晰，肾小管排列整齐，肾细胞的细胞核和细胞质结构清晰(图1-肾脏A)。与对照组相比，1 倍剂量组肾细胞间有大量血铁红素沉积，肾小球开始萎缩变形(图1-肾脏B)。随着口灌剂量的增加，3倍剂量组肾被膜内层平滑肌下有较多炎性细胞浸润，细胞松散，H.E.染色逐渐变浅(图1-肾脏C)；
5倍剂量组肾细胞出现裂解现象，肾小管结构模糊甚至完全消失，细胞H.E.染色变浅(图1-肾脏D)。
4.脾脏组织结构观察 对照组脾组织细胞结构明显，排列紧密(图1-脾脏A)。与对照组相比，1 倍剂量组椭圆体鞘室内有红细胞浸润(图1-脾脏B)。随着口灌剂量的增加，3 倍和5 倍剂量组脾组织细胞松散，细胞略微空泡化，胞核固缩，H.E.染色加深，中央动脉内有炎性细胞浸润(图1-脾脏C、D)。
5.睾丸组织结构观察 对照组观察到曲细精管边界线明显，结构完好无损，其内充斥着大量的生精细胞(图1-睾丸A)。与对照组相比，1 倍剂量组曲细精管内精子细胞开始减少(图1-睾丸B)。随着口灌剂量的增加，3 倍和5 倍剂量组睾丸实质内成熟精子细胞显著减少，结构损伤严重，甚至出现空腔现象(图1-睾丸C、D)。
6.精巢组织切片观察 对照组精巢曲细精管腔结构清晰，精小囊内充斥着大量生殖细胞群体(图1-精巢A)。与对照组相比，1 倍剂量组精小囊内生殖细胞逐渐减少(图1-精巢B)。随着口灌剂量的增加，3 倍和5 倍剂量组精巢组织受损严重，曲细精管腔壁肿胀，生精小管内成熟精子细胞严重减少，导致空腔现象出现(图1-精巢C、D)。
7.心脏组织结构观察 对照组心肌膜结构清晰，心肌纤维纵横交叉，排列有序(图1-心脏A)。与对照组相比，1倍剂量组胞核固缩、脱落，心肌纤维间浸润大量的炎性细胞(图1-心脏A、B)。随着口灌剂量的增加，3 倍和5 倍剂量组心肌纤维排列紊乱、断裂，结构破坏严重(图1-心脏C、D)。
8.肌肉组织切片观察 对照组、1 倍和3 倍剂量组，从纵切面对肌肉组织观察，肌细胞形态正常，肌纤维紧凑，平行排列(图1-肌肉A、C)；
与对照组相比，5倍剂量组肌纤维间隙增大，出现溶解现象，肌细胞核固化，甚至消失(图1-肌肉D)。
图1 口灌抗菌剂混合物(恩诺沙星和氟苯尼考)对中华鳖组织的病理变化
毒性数据是支持多种化学品风险评估的关键。Ding 等(2022)将泥鳅鳍细胞暴露于400、800、1 200 微摩/升恩诺沙星中，发现恩诺沙星抑制了细胞的增殖，产生细胞毒性。Qiu等(2020)以斑马鱼为研究对象，发现恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、头孢噻吩和四环素单一或联合用药对其早期发育和代谢系统有显著影响，且得出联合用药具有协同毒性的结论。以上研究可以看出，当特定药物联合使用时，可使毒性增加，并且会引起研究者对毒性的高度关注。
组织病理学提供了一个快速诊断，以检测鱼的各组织和器官在抗生素暴露后异常的方法。本实验探究了联合用药(恩诺沙星与氟苯尼考)对中华鳖的影响发现，高(5倍)、中(3倍)和低(1倍)剂量联合给药，均可造成中华鳖肠道、肾脏、肝脏、脾脏、睾丸和精巢等组织器官不同程度的病理损伤。损伤程度与剂量有关，5倍剂量组对各组织结构影响最大。主要表现为肠黏膜层相融、结构模糊，肝脏组织结构松散、血窦扩张，肾细胞裂解、肾小管消失，睾丸和精巢组织中成熟精子细胞显著减少，出现空腔现象，脾组织细胞空泡化、胞核固缩，有炎性细胞浸润，心肌纤维排列紊乱、断裂，肌肉肌纤维溶解、细胞核消失。Gaikowski 等(2013)在罗非鱼饲料中添加15、45、75 毫克/千克剂量的氟苯尼考(氟苯尼考推荐剂量的1、3、5 倍)，口服20 天后对组织观察发现，肝脏中糖原型和脂质型肝细胞空泡增加，淋巴细胞减少，肾小管上皮变性。Luan 等(2021)研究了恩诺沙星联合黏菌素、喹烯酮对SPF 大鼠的短期毒性，发现联合口服14 天后，可造成严重的肝组织损伤。上述结果与本研究一致。肠道、肝脏、脾脏、肾脏作为动物机体的抗氧化系统，组织中包含多种非特异性免疫酶，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶等，它们能够防止活性氧自由基引起的重要细胞损伤。当抗生素过量暴露或给药后，刺激动物机体内源性活性氧自由基过度积累，例如超氧阴离子和过氧化氢，在不同组织中超出抗氧化能力来抵消，阻碍解毒反应，随后引起组织脂质过氧化，诱导DNA 或RNA 损伤，进而增强抗生素对动物机体组织器官的毒性。
心脏为动物重要的循环系统器官，在血液循环和药物运输方面起到重要的作用，抗生素对血液成分产生影响，进而也会对心脏组织造成损伤。睾丸和精巢作为动物重要的生殖器官，过量使用抗生素，残留药物能在组织中积累，进而造成动物遗传毒性。氟喹诺酮类和四环素类抗生素的混合物可以通过改变转录和蛋白质水平来引起斑马鱼幼体的免疫毒性和心脏损伤(Li 等，2016；
Yin 等，2014)。以前对大鼠和狗的研究显示，多次口服氟苯尼考后会使血液参数发生变化，肝体指数增加和睾丸萎缩(欧洲药品管理局)。在本研究中也显示出相同的毒性。一般来说，养殖鱼大量口服抗生素后，机体会产生过量的活性氧自由基，导致染色体破裂、异常，破坏DNA 修复蛋白质的功能，从而诱发遗传毒性和细胞凋亡。
本研究表明，恩诺沙星和氟苯尼考联用可使毒性增加，对中华鳖的各个组织器官均可造成严重的损伤，且联合毒性具有剂量依赖性。高剂量的联合毒性作用最强，毒性顺序为：生殖器官＞排泄器官＞消化器官＞免疫器官＞循环器官。因此，在实际养殖疾病治疗时，必须合理规范使用抗菌药物，不可盲目增加给药剂量，以免对动物机体造成严重损伤，产生较大的经济损失。
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