苗期快速分选水稻人工无融合生殖克隆种子
曹跃炫 严绘景, 2 王克剑 刘朝雷, *
苗期快速分选水稻人工无融合生殖克隆种子
曹跃炫1严绘景1, 2王克剑1刘朝雷1, *
(1中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室, 杭州 310006;2河南师范大学 生命科学学院, 河南 新乡 453007;*通信联系人, email: liuchaolei@caas.cn)
【目的】人工无融合生殖系统的建立为水稻杂种优势固定提供了途径。当前人工无融合生殖系统在产生克隆种子的同时会伴随大量的四倍体种子，有必要开发简易高效的分选克隆种子方法。【方法】通过不同温度、盐浓度处理春优84和（同时突变和获得的可将减数分裂转化成有丝分裂的材料）种子萌发的幼苗，观察它们形态学上的差异，确定最佳筛选条件。在最佳条件下，处理材料（通过基因编辑技术同时突变、、和基因获得的可固定杂种优势的材料）种子萌发的幼苗，根据形态差异分选克隆种子。利用流式细胞术确定分选的效率。【结果】无融合生殖材料产生4.4%的克隆种子和95.6%的四倍体材料；
而材料的后代全是四倍体。利用滤网在23℃、28℃和32℃水温条件下萌发春优84和种子48 h，材料的初生根直径在3种温度处理下均显著大于春优84，以28 ℃处理最优。在28 ℃水温条件下，利用0%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5% NaCl溶液培养春优84和种子7 d，材料的根长、苗长与春优84无显著性差异，但春优84材料第1片完全叶在0.1%盐浓度下严重萎缩坏死，而材料受盐害影响较小。以28 ℃水温条件下先处理种子48 h，先通过初生根根直径差异进行初次筛选，再利用0.1% NaCl溶液培养7 d，观察第1片完全叶形态差异再次分选，最后挑选出来的单株利用流式细胞术验证，分选效率达61.1%。将获得的克隆植株和四倍体对照种植田间，至成熟期表现明显的植株形态差异。【结论】在水稻苗期，对无融合生殖材料进行温度及盐处理后，通过初生根、叶片等形态上差异可达到初步分选克隆植株的目标。
人工无融合生殖; 克隆种子分选; 温度处理; 盐处理; 形态差异
水稻是我国最主要的粮食作物。随着我国人口增长和耕地面积逐年减少，提高水稻产量对保障国家粮食安全和维护社会稳定具有重要意义。纵观我国水稻育种历史，已经有两次产量上的重大突破：第一次是矮化育种，水稻产量提高了20%～30%；
第二次是杂交稻育种，在矮化育种基础上水稻产量又提高了20%左右[1]。其中，杂交稻育种充分发挥了杂种优势的增产作用，使得水稻产量大幅度提高。我国在这方面研究非常成功，是世界上第一个在生产上利用水稻杂种优势的国家并一直处于领先地位[2]。
虽然杂交稻育种为世界粮食安全做出了重大贡献，但是由于遗传分离，杂交稻后代会发生性状分离，无法保持其杂种优势，不能留种继续使用。因此，每年必须花费大量的人力和物力进行繁琐的杂交种制种工作。在1987年，袁隆平先生提出了杂交水稻育种从“三系法”走向“两系法”，最终实现“一系法”的战略设想。其中，“一系法”是指利用无融合生殖固定杂种优势的育种方法[3]。所以，一直以来，将无融合生殖特性引入到水稻等主要农作物中进行杂种优势固定工作是农业领域的重要目标。
无融合生殖是指通过种子进行无性繁殖，是介于有性生殖和无性生殖之间的一种特殊的植物生殖方式，产生的后代与母体的基因组完全一致[4]。无融合生殖现象广泛存在于自然界，400多种植物通过无融合生殖方式繁殖下一代，但是水稻等主要农作物不具备这种生殖方式[5]。无融合生殖种子的发育过程非常复杂，包括三个不同的过程：绕过减数分裂形成基因组未减半的雌配子，未受精胚胎的发育和功能性胚乳自主发育[6]。虽然自然界中存在很多无融合生殖植物，对无融合生殖特性开展的研究也较多，但无融合生殖的形成机制十分复杂，涉及到减数分裂过程、植物双受精过程等多个植物生殖基本问题，至今自然发生的无融合生殖遗传机制仍不清楚，也无法应用于主要农作物中。
自然发生的无融合生殖条件为人工创制无融合生殖提供了线索与可能。首先，要绕过正常的减数分裂过程形成不重组且染色体数目未减半的克隆配子。在2016年，法国Rapha?l Mercier研究团队报道，同时突变水稻、和基因成功实现了有丝分裂替代减数分裂过程，即减数分裂时期表现为染色体进行一次复制，遗传信息不发生重组交换，细胞由原来的两次分裂变为仅进行一次分裂，最终形成的配子其染色体数目与体细胞一致[7]。这种绕过正常的减数分裂过程形成克隆配子方法被称为策略。其次，在策略的基础上将克隆配子诱导发育成种子，即诱导单性生殖。在水稻中卵细胞中异位表达花粉精细胞特异表达基因可以诱导胚胎单倍体发生[8]；
在水稻中突变谷类作物中高度保守的单倍体诱导基因也可诱导单倍体发生[9]。在2019年，Sundaresan研究团队将水稻卵细胞中异位表达与策略结合，成功获得了水稻克隆种子[10]。几乎同时，中国水稻研究所王克剑团队将单倍体诱导基因与策略结合形成策略，成功获得了杂交水稻的克隆种子[11]。
虽然策略可以固定杂合基因型，但是当前创制的人工无融合生殖体系产生的克隆种子比例比较低，大部分是四倍体种子，需要进行克隆种子分选工作。本研究在水稻苗期对人工无融合生殖材料进行不同温度、盐浓度处理，期望通过基于形态学差异快速分选克隆种子。
1.1 研究材料
本研究选用的杂交稻品种为春优84，是中国水稻研究所和浙江农科种业有限公司合作选育的粳型三系杂交水稻。在春优84中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，同时敲除、和获得材料；
同时敲除、、和获得材料。
1.2 载体构建与遗传转化
用于创造材料的多基因编辑载体pC1300ACT:Cas9-sgRNAOSD1-sgRNAPAIR1-sgRNAREC8和用于创造无融合生殖特性的材料的多基因编辑载体pC1300-ACT:Cas9-sgRNAOSD1-sgRNAPAIR1-sgRNAREC8-sgRNAMTL来源于前期工作[11]。采用农杆菌介导法进行遗传转化，转化材料为春优84，委托武汉伯远生物科技有限公司完成。将转基因阳性植株种植于中国水稻研究所转基因中间试验基地。
1.3 突变检测
取1～2 cm水稻幼嫩叶片，采用CTAB法[12]提取DNA。靶位点检测采用Hi-TOM法[13]。
1.4 温度处理
将春优84（种子萌发后为二倍体）、-T0（种子萌发后为四倍体）和-T0（种子萌发后存在少量二倍体和大量四倍体）用3%的次氯酸钠消毒20 min后，灭菌水冲洗3～5次，再浸泡于灭菌水中，放置于35 ℃恒温箱48 h。在3个10 L的周转箱中各加入5 L的清水，将水温分别调至23、28和32 ℃，再各放置1个漂浮的滤网。将露白的种子转移至漂浮的滤网上，种子摆放整齐后用锡箔纸盖上周转箱，然后将3个周转箱分别转移至23、28和32 ℃恒温箱进行种子发芽试验，每个处理30粒正常露白的种子。萌发48 h后，观察幼苗植株形态差异，测定初生根0.5 cm处的宽度。
1.5 盐处理
春优84、-T0和-T0种子前期准备如上文所述，在28℃进行发芽试验。种子萌发48 h后，将幼苗转移至NaCl浓度梯度（0%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%）中，放置在28℃光照恒温箱中生长（每个处理30株长势一致的幼苗，光照12 h，相对湿度为60%）。每天更换一次培养液，生长7 d后观察植株形态差异，测定地上部、地下部长度。
1.6 流式细胞术
剪取约4～5 cm长的新鲜水稻叶片放入干净的玻璃皿中，加入1 mL植物裂解缓冲液 LB01（Tris 363.4 mg，Na2EDTA 148.9 mg，精胺四盐酸盐34.8 mg，KCl 1.193 g，NaCl 233.8 mg，Triton X-100 200 μL，定容至200 mL，pH=7.5，220 μL巯基乙醇），用刀片垂直向下快速切碎组织（在冰上进行）。吸取培养皿内的裂解液，用50 μm尼龙网过滤至离心管中。利用台式冷冻离心机，在4℃、1 200 r/min条件下离心5 min。取出离心管，吸去上清液，加入450 μL LB01、25 μL预冷的碘化丙啶（PI）和25 μL核糖核酸酶A。于4℃下避光染色10 min。采用BD Accuri C6流式细胞分析仪进行检测。
1.7 材料繁殖
所有材料均种植于中国水稻研究所转基因中间试验基地，肥水管理按大田常规方法进行。于植株成熟期拍照记录。
1.8 数据分析
采用Microsoft Office Excel 2020和Adobe Illustrator CC Portable (AI) 2017软件进行数据处理。
2.1 基因编辑创制MiMe和Fix材料
为获得可将减数分裂转化成有丝分裂的材料[7]和具有无融合生殖特性的材料[11]，构建了多基因编辑载体pC1300ACT:Cas9-sgRNAOSD1-sgRNAPAIR1-sgRNAREC8和pC1300ACT:Cas9 -sgRNAOSD1-sgRNAPAIR1-sgRNAREC8-sgRNAMTL并遗传转化杂交水稻春优84，分别获得了30个和33个遗传转化植株。经Hi-TOM高通量测序平台鉴定分析后[13]，发现、和多基因敲除后，株系存在基因突变的比例达90.0%，有13个独立株系出现、和三个基因同时突变，获得率达43.3%；
、、和多基因敲除时，株系存在基因突变的比例达97.1%，有10个独立株系发生4个基因同时突变，获得率达29.4%（图1-A）。从13个材料和10个材料各选2个株系进行下一步试验（图1-B～C）。其中，和在、和基因靶位点上均是双等位突变，包括插入和缺失两种突变类型；
和在和靶位点上均发生1 bp插入纯合突变，在靶位点上是双等位突变，在靶位点上是双等位突变，则是1 bp插入纯合突变。上述所有突变类型均造成对应基因转录翻译提前终止。
2.2 建立不同温度处理下形态差异区分标准
研究报道二倍体与四倍体水稻对温度敏感性不同[14]，因此期望通过不同温度处理无融合生殖材料，利用二倍体与四倍体水稻幼苗形态学上差异达到快速区分克隆种子目的。为建立不同温度处理下形态差异区分标准，将正常条件浸种露白后的二倍体春优84和四倍体种子放置在23、28和32 ℃温度下生长48 h。如图2所示，低温对水稻生长存在明显的抑制作用，但根长受抑制程度低于春优84，说明四倍体比二倍体水稻更具耐低温能力。此外，在23℃、28℃和32℃三种温度处理条件，材料初生根均显著粗于春优84，且达到了可以完全区分开的标准（图2）。选用温度处理时，以28℃处理最优，对水稻生长抑制作用弱，初生根粗细最易辨别。
A—转基因植株突变统计；
B，C—MiMe和Fix材料靶位点突变情况。蓝色字母、横杠表示突变碱基；
红色字母表示PAM序列。D―缺失；
I―插入。
Fig. 1. Generation ofandmaterials.
A～F—23、28和32℃下春优84和MiMe幼苗表型，标尺=2 cm；
G～I—初生根宽度统计(n=10)，**表示采用t检验差异达0.01极显著水平。
Fig. 2. Morphological phenotype of diploid and tetraploid seedlings under different temperature treatments.
2.3 建立不同盐处理下形态差异区分标准
盐害是一种对植物生长危害非常严重的逆境，而四倍体水稻可以提高水稻的耐盐性[15]。为建立不同盐处理下形态差异区分标准，将正常条件浸种露白后的二倍体春优84和四倍体种子放置在28℃下生长48 h，然后转移至不同浓度NaCl溶液（0%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%）中生长7 d。如图3所示，随着盐浓度的升高，水稻受到的盐害作用越大。当盐浓度达到0.5%时，春优84和幼苗已经接近枯死状态。无论何种盐浓度处理，春优84和幼苗根长和芽长均达不到可以明显区分的标准（图3-A～B）。但是，在0.1%盐浓度处理条件下，春优84幼苗第一片叶严重枯死，而幼苗第一片叶则受影响较小（图3-C），该形态差异可以作为一个区分标准。
2.4 分选人工无融合生殖克隆种子
选用500粒植株种子，正常条件浸种露白后放置28 ℃温度下生长48 h，根据初生根粗细筛选出78株假定的克隆植株。然后将这78株转移至0.1%盐浓度生长7 d，根据幼苗第一片叶生长情况筛选出36株假定的克隆植株。最后，利用流式细胞术鉴定36株假定的克隆植株，发现22株为克隆植株（图4-A）。通过温度和盐处理，分选人工无融合生殖克隆植株效率达到了61.1%。将鉴定出的克隆植株和四倍体材料种植于田间，四倍体植株表现明显的四倍体特征，例如分蘖少、茎秆粗壮，种子具有长芒等（图4-B～C）。
无融合生殖策略可以固定杂种优势产生克隆种子，但是克隆种子比例较低，大部分为加倍的四倍体种子[11]，需要进行克隆种子分选工作。虽然克隆种子与四倍体水稻在生长后期表现明显的形态差异，例如四倍体水稻分蘖少、茎秆粗壮、叶色深、结实率低、种子芒较长[16]，可以根据这些形态特征进行区分，但是生长前期播种大量的四倍体植株会占用较大的耕地面积，后期若要田间清除四倍体植株也麻烦，如果继续保留四倍体植株至成熟期，结实率也极低[16]，无法应用。因此，必须在种子阶段或苗期建立快速区分克隆种子或植株的方法。
A—0%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5% NaCl溶液处理春优84和MiMe幼苗表型，标尺 = 5 cm；
B—芽长和根长统计，10次重复，*表示采用t检验差异达到0.05显著水平；
C—0.1%盐处理下春优84和MiMe幼苗第一片叶表型。CY84—春优84。
Fig. 3. Morphological phenotype of diploid and tetraploid seedlings under different salt treatments.
A—500粒Fix种子在28℃下萌发处理后，根据初生根粗细筛选78个假定的克隆植株；
再通过0.1%盐处理7 d，根据第1片叶枯死情况筛选36个假定的克隆植株；
最后采用流式细胞术鉴定出22株克隆植株；
B—克隆Fix和四倍体植株流式细胞术结果；
C—田间克隆Fix和四倍体成熟期植株，标尺=20 cm；
D—田间克隆Fix和四倍体成熟期植株分蘖数、株高、穗长、一次枝梗数和结实率(n=6)，*和**分别表示采用t检验差异达到0.05和0.01显著水平。
Fig. 4. Identification of clonal seeds generated by synthetic apomixis.
由于克隆种子与四倍体材料存在倍性差别，可根据此差异选用种子阶段或水稻苗期区分克隆种子的方法。流式细胞术是鉴定植物倍性常用的方法，检测结果准确可靠[17]。但是应用该方法分选克隆种子时，耗费人力、物力，效率较低，不适用于规模化克隆种子的快速分选。二倍体与四倍体水稻对逆境反应不同，一般情况下四倍体水稻更具有更强的抗逆性[14-16]。二倍体抗逆性较弱，在逆境处理时不宜过度处理，以免造成克隆植株死亡。温度和盐是水稻常见的逆境[18-19]，本研究中选用了这两种逆境进行了实验。结果表明，适当低温可以造成二倍体与四倍体水稻初生根粗细形态差别，容易辨别，后期可考虑机器扫描设定阈值进行机械化区分。而低浓度盐处理可以造成二倍体第1片叶枯死，而四倍体幼苗几乎不受影响，是一个很好的形态标记。利用低温和盐处理，筛选效率为61.1%，达到了初筛克隆种子目标，但也需要进一步优化。此外，应用荧光标记、光谱学等技术分选克隆种子也具有一定应用前景。
[1] 袁隆平. 从育种角度展望我国水稻的增产潜力[J]. 杂交水稻, 1996(4): 1-2.
Yuan L P. Prospects for yield potential in rice through plant breeding[J]., 1996(4): 1-2. (in Chinese with English abstract)
[2] 袁隆平. 中国的杂交水稻[J]. 中国水稻科学, 1986(1): 18.
Yuan L P. Hybrid rice in China[J]., 1986(1): 18. (in Chinese with English abstract)
[3] 袁隆平. 杂交水稻的育种战略设想[J]. 杂交水稻, 1987, 1(1): 1-3.
Yuan L P. The strategy of hybrid rice breeding[J]., 1987, 1(1): 1-3. (in Chinese)
[4] 张燕, 王春, 王克剑. 人工创制植物无融合生殖的研究进展[J]. 科学通报, 2020, 65(27): 2998-3007.
Zhang Y, Wang C, Wang K J. Research advances on plant synthetic apomixes[J]., 2020, 65(27): 2998-3007. (in Chinese with English abstract)
[5] Grossniklaus U, Nogler GA, van Dijk P J. How to avoid sex: The genetic control of gametophytic apomixis[J]., 2001, 13(7): 1491-1497.
[6] Kaushal P, Dwivedi K K, Radhakrishna A, Srivastava M K, Kumar V, Roy A K, Malaviya D R. Partitioning apomixis components to understand and utilize gametophytic apomixis[J]., 2019, 10: 256.
[7] Mieulet D, Jolivet S, Rivard M, Cromer L, Vernet A, Mayonove P, Pereira L, Droc G, Courtois B, Guiderdoni E, Mercier R. Turning rice meiosis into mitosis[J]., 2016, 26(11): 1242-1254.
[8] Conner JA, Podio M, Ozias-Akins P. Haploid embryo production in rice and maize induced by PsASGR-BBML transgenes[J]., 2017, 30: 41-52.
[9] Yao L, Zhang Y, Liu C, Liu Y, Wang Y, Liang D, Liu J, Sahoo G, Kelliher T.mutation induces haploid seed formation in indica rice[J]., 2018, 4(8): 530-533.
[10] Khanday I, Skinner D, Yang B, Mercier R, Sundaresan V. A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds[J]., 2019, 565(7737): 91-95.
[11] Wang C, Liu Q, Shen Y, Hua Y F, Wang J J, Lin J R, Wu M G, Sun T T, Cheng Z K, Mercier R, Wang K J. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes[J]., 2019, 37(3): 283-286.
[12] Allen G C, Flores-Vergara M A, Krasynanski S, Kumar S, Thompson W F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethyl- ammonium bromide[J]., 2006, 1(5): 2320-2325.
[13] Liu Q, Wang C, Jiao X, Zhang H, Song L, Li Y, Gao C, Wang K. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems[J]., 2019, 62(1): 1-7.
[14] Yu H, Li Q, Li Y, Yang H, Lu Z, Wu J, Zhang Z, Shahid M Q, Liu X. Genomics analyses reveal unique classification, population structure and novel allele of neo-tetraploid rice[J]., 2021, 14(1): 16.
[15] Wang L, Cao S, Wang P, Lu K, Song Q, Zhao F J, Chen Z J. DNA hypomethylation in tetraploid rice potentiates stress-responsive gene expression for salt tolerance[J]., 2021, 118(13): e2023981118.
[16] Chen R, Feng Z, Zhang X, Song Z, Cai D. A new way of rice breeding: Polyploid rice breeding[J]., 2021, 10(3): 422.
[17] 弓娜, 田新民, 周香艳, 刘建全. 流式细胞术在植物学研究中的应用: 检测植物核DNA含量和倍性水平[J]. 中国农学通报, 2011, 27(9): 21-27.
Gong N, Tian X M, Zhou X Y, Liu J Q. Applications of flow cytometry in plant research: Analysis of nuclear DNA content and ploidy level in plant cells[J]., 2011, 27(9): 21-27. (in Chinese with English abstract)
[18] 徐青山, 黄晶, 孙爱军, 洪小智, 朱练峰, 曹小闯, 孔亚丽, 金千瑜, 朱春权, 张均华. 低温影响水稻发育机理及调控途径研究进展[J]. 中国水稻科学, 2022, 36(2): 118-130.
Xu Q S, Huang J, Sun A J, Hong X Z, Zhu L F, Cao X C, Kong Y L, Jin Q Y, Zhu C Q, Zhang J H. Effects of low temperature on the growth and development of rice plants and the advance of regulation pathways: A review[J]., 2022, 36(2): 118-130. (in Chinese with English abstract)
[19] 王洋, 张瑞, 刘永昊, 李荣凯, 葛建飞, 邓仕文, 张徐彬, 陈英龙, 韦还和, 戴其根. 水稻对盐胁迫的响应及耐盐机理研究进展[J]. 中国水稻科学, 2022, 36(2): 105-117.
Wang Y, Zhang R, Liu Y H, Li R K, Ge J F, Deng S W, Zhang X B, Chen Y L, Wei H H, Dai Q G. Rice response to salt stress and research progress in salt tolerance mechanism[J]., 2022, 36(2): 105-117. (in Chinese with English abstract)
Rapid Identification of Rice Clonal Seeds Generated by Synthetic Apomixis at Seedling Stage
CAO Yuexuan1, YAN Huijing1, 2, WANG Kejian1, LIU Chaolei1, *
(1State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China;*Corresponding author, email: liuchaolei@caas.cn)
【Objective】The establishment of synthetic apomixis provides a way to fix heterosis in hybrid rice. However, synthetic apomixis only produces few clonal seeds with many tetraploid seeds. Thus, it is necessary to develop a simple and efficient method to select cloned seeds through the synthetic apomixis.【Method】The seedlings of Chunyou84 and(the,andwere simultaneously mutated, which can turn meiosis into mitosis in rice) were exposed to different temperature and salt concentrations, and their morphological differences were identified to determine the best treatment conditions. Then, seedlings germinated fromplants(The,,andwere simultaneously mutated in hybrid rice Chunyou84by genome editing technology) were treated in the optimal treatment conditions, and cloned seeds were sorted according to morphological differences. Finally, flow cytometry was used to determine the efficiency of the distinguishing cloned seeds method.【Results】plants produce 4.4% clonal seeds and 95.6% tetraploid plants, while the descendants ofare all tetraploid materials. The seeds of Chunyou84 andwere germinated on a net floating on deionized water at 23 ℃, 28 ℃and 32 ℃for 48 h, and the primary root diameter ofwas foundsignificantly larger than that of Chunyou 84under all the three treatments at the most favorable temperature of 28 ℃. Then, the seedlings of Chunyou 84 andwere cultured with 0%, 0.05%, 0.1%, 0.2% and 0.5% NaClsolutions for 7 days. Though the root and shoot length did not show significant difference between Chunyou 84 andplants, the first complete leaf from Chunyou 84 exhibited severe atrophic and necrosis phenotype in 0.1% NaClsolution, while theplants were slightly affected by salt damage. According to the above results, firstly, we germinated theseeds on a net floating on deionized water at 28 ℃for 48 h, and screened the putative clonedplants by observing the primary root. Then, the putative clonedplants were cultured with 0.1% salt solution for 7 days, and the putative tetraploid plants were discarded based on the salt damage of the first complete leaf. Finally, the selected individual plants were verified by flow cytometry with screening efficiency of 61.1%. The cloned plants were grown in field and showed significant difference with tetraploid plants at maturitystage.【Conclusion】After temperature and salt treatment of apomixis materialseeds at seedling stage, the clonalplants can be roughly screened by morphological differences of root and leaf phenotype.
synthetic apomixes; clonalscreening; temperature treatment; salt treatment; morphological difference
10.16819/j.1001-7216.2022.220509
2022-05-06;
2022-07-13。
国家水稻产业技术体系专项（CARS-01-07）。
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