葛根素对小白菜镉损伤的保护作用研究
胡远锋 张 明 范淑英 葛 菲 朱卫丰 肖旭峰，*
（1江西农业大学农学院，江西南昌 330045；
2江西生物科技职业学院动物科学系，江西南昌 330200；
3江西中医药大学药学院，江西南昌 330004）
近年来，谷物、蔬菜、油料种子及其加工农产品中镉（Cd）含量超标事件频频发生。Cd被植物吸收后在体内富集，由根向地上部茎叶中转运，最后到达种子，Cd毒害一方面改变植物多种生理和生化过程，如生长发育、细胞分裂、光合作用、酶活性和渗透平衡等［1-3］，引起产量下降；
另一方面通过“土壤-植物-人类”体系，在植物中富集后由食物链进入人体，导致各种疾病发生，严重危害人类的生命健康［4］。因此，在当今食品安全形势日益严峻的情况下，寻找解决蔬菜中Cd超标的防治方法已刻不容缓。
葛根素（puerarin，PUE）是一种植物异黄酮类衍生物，来源于豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，具有降血压、血脂、血糖，清除自由基，抗氧化等多种药理活性作用［5］。在动物研究中，葛根素是一种自由基清除剂，在细胞氧化损伤中可起到保护作用。如Zhou等［6］研究发现葛根素在Cd胁迫大鼠致肝毒性损伤中具有明显的保护作用，该机制可能与葛根素抑制细胞凋亡，恢复自噬通量和提高抗氧化酶活性等密切相关；
Wan等［7］同样发现葛根素通过抑制氧化应激和炎症反应减轻了Cd胁迫引起的小鼠肝损伤。然而，关于葛根素应用于植物中是否也有类似保护功能却鲜见相关报道。在葛根生产栽培中存在大量提取葛粉后剩余的葛渣，以及丢弃无用的葛藤和葛叶，而这些葛渣、葛藤和葛叶中均含有葛根素。实现这些废弃物的循环利用将有望提高葛根的生产效益。为此，本研究采取外源添加不同浓度葛根素处理，研究葛根素对Cd致小白菜幼苗损伤的保护效果，以期为葛根素在Cd污染防治和提高蔬菜产量等方面的应用提供参考依据。
1.1 试验材料与主要试剂
供试小白菜（Brassica chinensisL.）品种为矮脚上海青，由日本株式会社目宇种苗园提供；
葛根素购买于酷尔化学科技（北京）有限公司。
1.2 试验设计
试验于2021年5月在江西农业大学园艺系实验室中进行。育苗室的平均昼夜温度为22±3℃，相对湿度为70%±5%。挑选大小相似、形态完整、长势饱满程度相近的小白菜种子撒播在土壤中。待幼苗长至2叶1心时，选取长势一致的幼苗移栽至霍格兰营养液（Hoagland）中。缓苗7 d后随机分成7组，分别向营养液中加入相应浓度的CdCl2·2.5H2O及葛根素，处理组依次为对照组（CK）、葛根素组（PUE 30 μmol·L-1）、镉组（Cd 4 mg·L-1）、镉与葛根素共处理组（Cd 4 mg·L-1+PUE 15μmol·L-1、Cd 4 mg·L-1+PUE 30μmol·L-1、Cd 4 mg·L-1+PUE 45 μmol·L-1、Cd 4 mg·L-1+PUE 60 μmol·L-1），分别标记为CK、PUE30、Cd4、4+15、4+30、4+45、4+60，每处理4株，重复3次，其中CK组不添加任何Cd和葛根素。营养液每7 d更换1次，每天搅拌3次，30 d后收获，取每盆中的4株根系和叶片（随机选取大小叶片）的混样，并重复3次。样品切碎后用液氮速冻，并放于-80℃超低温冰箱保存，用MM400冷冻混合器球磨机（德国Retsch公司）粉碎样品，分装后用于测定相关生理特性指标。
1.3 测定项目及方法
1.3.1 生长指标测定观察处理30 d后的小白菜植株形态特征，并使用AE124电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）测定小白菜植株地下部和地上部的鲜重。
1.3.2 Cd含量测定采用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法测定小白菜根和叶的Cd含量。其中根系和叶片均取每盆4株植株研磨后的混样，按平行试验重复3次。取0.2 g研磨后的样品放入聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL硝酸。静置反应后，放入ETHOS ONE微波消解仪（北京莱伯泰科仪器股份有限公司）进行消解。待温度降至50℃以下时，取出消解罐放入通风橱内，打开消解罐用超纯水冲洗，转移到50 mL容量瓶中冲洗3～4次，用超纯水稀释并定容至50 mL，最后测定Cd含量。ICP-MS光谱仪电感耦合等离子体质谱仪（美国Thermo公司）的参数设置如下：射频功率1 550 W；
泵速40 r·min-1；
雾化室温度2.7℃；
采样深度5 mm；
冷却气流速14 L·min-1；
辅助气流速0.8 L·min-1；
雾化器气流速0.9 L·min-1。
1.3.3 氧化损伤相关指标测定选取功能叶的同一部位，采用SPAD502叶绿素仪（日本柯尼卡美能达公司）测定叶绿素含量；
丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid method，TBA）显色法进行测定；
H2O2含量采用A064-1-1过氧化氢试剂盒（南京建成科技有限公司）进行测定，测定方法参考其说明书。
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性参考Giannopolitis等［8］的方法进行测定；
过氧化物酶（peroxidase，POD）活性参考王伟玲等［9］的方法进行测定；
抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性参考Nakano等［10］的方法进行测定；
过氧化氢酶（catalase，CAT）活性参考Aebi［11］的方法进行测定。Vc含量参考Zhang等［12］的方法进行测定；
可溶性蛋白含量参考《植物生理生化实验原理和技术》［13］的方法进行测定。UV-2600紫外分光光度计（日本岛津公司）用于测定POD、CAT和APX酶活性；
Spectra MAX M2多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）用于测定H2O2、MDA、VC、可溶性蛋白含量和SOD活性。
1.4 抗氧化酶基因表达特性分析
总RNA提取和荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法分别参照Trizol试剂盒（日本TaKaRa公司）及PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒（日本TaKaRa公司）说明书。根据美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库已发表的其他物种抗氧化酶基因的序列，设计超氧化物歧化酶基因（Cu/Zn-SOD）、过氧化物酶基因（POD）、抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）和过氧化氢酶基因（CAT）的引物并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成（见表1）。
表1 抗氧化酶相关基因的引物序列Table 1 Primers of the anti-oxidative enzyme genes
1.5 数据分析
本文中数据均为3组平行试验的平均值±标准差，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0软 件 进行数据处理和统计分析，通过最小显著差异法（least significant difference，LSD）进行显著性检验。
在实际应用中，由于光学装调误差、环境温度、发射和接收平台振动等会引入光纤对准误差和光束随机抖动误差，致使模场匹配程度下降，耦合效率降低，从而导致接收端信噪比下降，误码率提高，通信质量变差.接下来将推导并建立不同影响因素下空间光-少模光纤耦合效率的数理模型.
2.1 葛根素对Cd胁迫下小白菜幼苗生长量的影响
由图1可知，PUE30组的小白菜株型较CK组更大，根系更发达，叶色浓绿，长势更佳。与单一Cd组相比，添加较低浓度葛根素（≤30μmol·L-1）能使小白菜植株生长更旺盛，叶色更绿；
但较高浓度葛根素（≥30μmol·L-1）处理差异不明显。由表2可知，小白菜地下部鲜重随葛根素浓度的升高而逐渐增加，但地上部鲜重与之相反，呈现“低促高抑”变化，当葛根素浓度≤30μmol·L-1时，小白菜的地上部鲜重高于单一Cd处理组；
当葛根素浓度>30μmol·L-1时，地上部鲜重较Cd4处理有所降低，并在60μmol·L-1达到显著差异（P<0.05）。
图1 各处理的小白菜植株形态差异Fig.1 Morphological differences of pakchoi seedlings
表2 小白菜幼苗地下部重和地上部鲜重Table 2 Root weight and fresh weight of pakchoi seedlings
2.2 葛根素对小白菜根和叶中Cd吸收量的影响
由表3可知，外源添加葛根素对Cd胁迫下小白菜根系Cd含量存在低浓度抑制、高浓度促进的影响。与单独镉处理相比，较低浓度葛根素处理（≤30μmol·L-1）均可降低小白菜根和叶中的Cd含量，并在根系中达到显著性差异，有效缓解植株的Cd毒害；
但随着葛根素浓度升高（>30μmol·L-1），小白菜根和叶中Cd含量呈现上升趋势，并在45μmol·L-1浓度下达到显著差异（P<0.05）。
表3 小白菜根和叶中Cd含量Table 3 Cd content in the roots and leaves of pakchoi/（mg·kg-1）
2.3 葛根素对Cd胁迫下小白菜叶片中H2O2和MDA含量的影响
由图2可知，Cd4组小白菜叶中的H2O2含量较CK组、PUE30组显著升高（P<0.05）；
PUE30组小白菜叶中MDA含量较CK组、Cd4组显著降低（P<0.05）；
与Cd4处理组相比，Cd+PUE共处理组小白菜叶中的H2O2和MDA含量均显著降低（P<0.05），且二者的变化趋势基本一致，均随葛根素浓度的升高而逐渐增加，这说明Cd胁迫使小白菜叶细胞发生氧化损伤，而葛根素可清除植物体内自由基，降低膜脂过氧化损伤。
图2 小白菜叶中H2O2和MDA含量Fig.2 H2O2 and MDA content in pakchoi leaves
2.4 葛根素对Cd胁迫下小白菜叶片中叶绿素含量的影响
由图3可知，与CK相比，PUE30组的叶绿素含量无显著差异；
而Cd4组的叶绿素含量则显著降低（P<0.05）。与PUE30组相比，Cd+PUE共处理组小白菜叶中的叶绿素含量均显著降低。与单独镉处理（Cd4）相比，Cd+PUE共处理组小白菜叶中的叶绿素含量均显著增加，但Cd+PUE共处理组组间差异不显著。综上，葛根素的添加能有效减轻Cd毒性对小白菜叶绿素的破坏。
图3 小白菜叶中叶绿素含量Fig.3 Chlorophyll content of pakchoi leaves
2.5 葛根素对Cd胁迫下小白菜叶片中抗氧化酶的影响
由图4可知，与CK但相比，单一Cd处理下（Cd4）的POD和APX活性均显著降低。与PUE30组相比，Cd4组的CAT活性显著升高，SOD和POD活性显著下降（P<0.05）。与Cd4组相比，Cd+PUE共处理组的SOD、POD、APX及CAT活性整体显著提高。其中，4+15、4+30、4+45和4+60处理组的SOD活性分别较Cd4组增加了35.66%、34.98%、32.61%和18.89%；
POD活性分别较Cd4组增加了511.70%、598.79%、478.94%和586.23%；
APX活性分别较Cd4组增加了74.30%、55.09%、38.91%和32.14%；
CAT活性分别较Cd4组增加了73.06%、9.70%、20.74%和30.19%。上述结果表明，外源葛根素添加能明显提高小白菜植株的抗氧化能力，维持Cd胁迫下氧化还原反应的平衡。
图4 小白菜叶中抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activity in pakchoi leaves
2.6 葛根素对Cd胁迫下小白菜叶片中Vc和可溶性蛋白含量的影响
由图5可知，与CK组相比，单独葛根素处理组（PUE30）的可溶性蛋白含量显著增加；
与CK组相比，Cd4组中Vc、可溶性蛋白含量均有不同程度升高；
与单一Cd处理（Cd4）相比，除4+15处理外，Cd+PUE共处理组的Vc和可溶性蛋白含量均显著增加（P<0.05），其中Vc含量增幅随葛根素浓度增加呈下降趋势，而可溶性蛋白含量增幅则呈上升趋势。综上，葛根素添加能提高Cd胁迫下小白菜叶中Vc、可溶性蛋白的含量，在一定程度上缓解Cd毒性损伤。
图5 小白菜叶中Vc和可溶性蛋白含量Fig.5 Vc and the soluble protein contents in root of pakchoi leaves
2.7 葛根素对Cd胁迫下小白菜叶片中抗氧化酶基因表达的影响
图6 小白菜叶中抗氧化酶基因表达量Fig.6 Expression level of antioxidant enzyme genes of pakchoi leaves
Cd是一种毒性强、危害大，且污染性高的重金属。大量研究表明，我国城郊、农村露地或大棚蔬菜种植的Cd污染问题较严重，其中叶菜类蔬菜尤为突出［14-15］。本试验表明，低浓度（≤30 μmol·L-1）的葛根素降低了小白菜根部的Cd含量，但高浓度特别是45 μmol·L-1的葛根素对小白菜根部Cd含量呈现促进作用，这可能是由于高浓度葛根素处理使根系受到伤害，根系细胞膜透性增加［16］，导致进入根系的Cd含量增加。
前人研究表明，Cd2+会破坏小白菜体内细胞膜渗透性，产生过量活性氧，造成细胞脂质代谢紊乱，抑制种子萌发和幼苗生长等［17］。本研究发现，Cd胁迫下小白菜H2O2和MDA含量较对照明显升高，且伴随有地下、地上部鲜重、抗氧化酶（SOD、POD和APX）活性、叶绿素含量不同程度的降低，说明Cd胁迫对小白菜形态和生理代谢产生了严重的毒害作用，这与前人研究结果一致［18-21］。
葛根素具有极强的抗氧化性，对机体有重要的保护作用［22］。本研究发现，与CK组相比，单一PUE处理组小白菜的地下、地上部鲜重和可溶性蛋白含量均明显升高，说明适当剂量的葛根素可促进小白菜机体生长，这可能与低剂量黄酮类化合物对生长性能有促进作用有关，李博萍等［23］和余应梅等［24］关于葛根素对大鼠和肉鸡机体生长影响的研究也支持了上述观点。
氧化应激是Cd致机体毒性的重要机制之一，而葛根素具有良好的抗氧化效果［25］。本研究发现，Cd+PUE共处理组中小白菜地下部鲜重随葛根素浓度的升高而明显增加，但地上部鲜重呈逐渐降低趋势，根系Cd含量整体呈先降低后增加趋势，说明葛根素可保护Cd胁迫下小白菜的根系生长，适当剂量葛根素可抑制Cd吸收；
但当葛根素浓度高于45 μmol·L-1时，Cd和PUE可能协同抑制了小白菜幼苗生长。王昌等［26］发现葛根素对大鼠成骨细胞增殖与分化存在剂量依赖性和双向性的影响，即低浓度葛根素促进骨细胞形成，而高浓度则呈现抑制作用；
Króliczewska等［27］同样发现高剂量黄酮类化合物可能对肉鸡生长性能有抑制作用。可见不同浓度葛根素在动物研究中的作用是具有双向性的，本研究同样发现适宜低剂量的葛根素才对小白菜镉损伤有保护作用。
本研究发现，与单一Cd处理组相比，Cd+PUE共处理组明显降低了小白菜叶中的H2O2和MDA含量，说明小白菜通过吸收葛根素直接清除活性氧分子，减轻Cd胁迫引起的膜脂过氧化损伤。同时，Cd+PUE共处理组的叶绿素、Vc、可溶性蛋白含量及SOD、POD、CAT和APX活性均较Cd4组整体显著升高，这与闻双全等［25］与张文华等［28］研究葛根素缓解大鼠Cd损伤的研究结果类似。说明葛根素可以通过增强抗氧化酶的活性来稳定Cd引起的氧化还原失衡，也再次印证了葛根素的保护机制可能和较强的自由基清除作用有关，即葛根素可通过恢复Cd毒害引起的脂质代谢紊乱来减轻Cd导致的小白菜细胞氧化损伤。
本试验发现，与CK组相比，Cd4组POD和APX基因表达显著下调，导致小白菜抗氧化能力减弱，使小白菜幼苗受到Cd损伤。与单一Cd处理组相比，Cd+PUE共处理组Cu/Zn-SOD、POD、APX和CAT基因均有不同程度上调。可见，低剂量（≤30 μmol·L-1）葛根素可能刺激了小白菜体内的抗氧化机制，使得各种抗氧化酶基因的表达量整体上调，加速相应酶蛋白的合成，进而使抗氧化酶活性升高并加速H2O2分解，同时及时清除机体内过量的活性氧来减轻机体损伤，这与张蓓等［29］和Hussain等［30］的研究结果相类似。
综上所述，葛根素作为一种天然抗氧化剂，可提高小白菜叶中的抗氧化酶活性，减轻自由基对小白菜幼苗的损伤，对Cd胁迫引起的小白菜氧化损伤具有一定的保护作用，但存在剂量依赖性和双向性。
本研究结果表明，Cd胁迫下，小白菜的形态和生理代谢遭受了严重的Cd毒害作用，主要表现为抗氧化酶基因表达水平降低，抗氧化系统受损。适宜剂量（≤30 μmol·L-1）的葛根素处理可促进小白菜生长，增强小白菜在Cd胁迫下的抗性，增强抗氧化机制，减轻Cd引起的氧化损伤。
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