禽腺病毒4型湖北株的分离鉴定及其Fiber2蛋白在乳酸菌中的表达
李 剑， 徐鹏飞， 叶十一， 陈红心， 周启立， 翁长江， 熊 涛
(1.长江大学生命科学学院，湖北荆州 434000；
2.大北农集团湖北分公司，湖北武汉 430000；
3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨 150069)
禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)是一种直径为60～90 nm的无囊膜双股DNA病毒，分为3个群，Ⅰ群又分为A～E 5个种，12个血清型[1-2]。其中，禽腺病毒4型(FAdV-4)是引起鸡肝炎-心包积液综合征的病原体，1987年该病首次被发现于巴基斯坦的安卡拉，随后在北美洲、南美洲和亚洲等地传播[3-4]。2015年6月以来在我国多个省份呈爆发式传播，病死率高达80%，给我国养禽业造成了极大的损害[5]。其中，以山东、山西、广西和江苏等地的毒株报道[6-10]最多，而湖北地区的毒株鲜有报道。所以，研究湖北地区禽腺病毒4型流行病学和遗传进化尤为重要。禽腺病毒的衣壳蛋白有Hexon、Penton和Fiber 3种主要结构蛋白。其中，Hexon是衣壳含量最高的蛋白，携带主要的属和亚属特异性抗原决定簇，基因序列较为保守，能用于禽腺病毒的进化分析和类型区分[11]。Fiber分为Fiber1和Fiber2 2条蛋白，Fiber2长度比Fiber1短，且Fiber2比Fiber1蛋白活性更好[12]。Fiber2蛋白具有型和亚群特异性抗原决定簇，能够识别宿主细胞的特异受体并与受体相结合，从而介导病毒的感染，诱导机体产生病毒特异性中和抗体，在免疫反应方面起重要的作用[13-14]。因此，Fiber2蛋白可作为基因工程亚单位疫苗的候选者。田开月等成功在大肠杆菌中表达了禽腺病毒4型的Fiber2蛋白，而国内学者对禽腺病毒4型的Fiber2蛋白在乳酸菌中表达研究较少[15]。本研究将采集于湖北省某养鸡场的病变组织样处理后接种鸡肝癌细胞(LMH)，分离出2株禽腺病毒，对其进行PCR鉴定和Hexon基因测序分析，并根据Hexon基因序列分析结果研究其遗传进化关系，并以其基因组DNA为模板扩增出Fiber2基因，构建乳酸菌重组表达系统，并对Fiber2蛋白进行表达，以期为禽腺病毒4型口服疫苗的研究提供理论基础。
1.1 细胞及病料
细胞：LMH购自美国生物资源中心(ATCC)，由本实验室传代冻存。
病料：病死鸡肝脏等病变组织样，2020年9月10日无菌采集于湖北省荆州市某养鸡场，冻存备用。
1.2 引物合成及测序
引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.3 主要试剂
Waymouth’s MB 752/1培养基、澳洲胎牛血清、胰蛋白酶、青-链霉素双抗、Gelatin，均购自Gibco公司；
病毒基因组DNA提取试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；
质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；
pMD-18T 载体、HindⅢ和XbaⅠ限制酶，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；
pNZ 8148-MC 1061、MC 1061、NZ 9000菌种，均购自上海瑞楚生物科技有限公司；
乳酸链球菌素(Nisin)，购自北京酷来搏科技有限公司；
NC膜，购自北京欣华绿源科技有限公司；
HRP标记的羊抗鼠 IgG、小鼠抗 6His-tag 单克隆抗体，均购自Proteintech公司；
Omni-ECL 基础型化学发光检测试剂盒，购自上海雅酶生物医药科技有限公司。
1.4 病料的处理
2020年9月13日于长江大学生命科学学院生物安全实验室取收集到的病变组织按1 g ∶10 mL加入PBS缓冲液研磨，反复冻融3次，8 000 r/min离心20 min后取上清。过滤除菌后按1 ∶1 000体积比加入青-链霉素双抗，-80 ℃保存待用。
1.5 病毒的分离
LMH细胞进行传代培养后，待LMH细胞长满80%时，弃去培养液并用PBS缓冲液洗2次，将待用病毒悬液按1 ∶10体积比接入LMH细胞，37 ℃孵育60 min，然后加入含1%胎牛血清的培养液，同时设正常的细胞阴性对照，37 ℃、5% CO2培养箱培养3～5 d。每日观察LMH细胞的病变情况，待LMH细胞出现80%病变反复冻融3次后，6 000 r/min 离心15 min收集病毒上清，-80 ℃保存。按照上述方法将病毒悬液盲传3代。
1.6 PCR检测
参考GenBank中登录的FAdV-4的Hexon基因序列(登录号为MK650194.1)，采用Primer Premier 5.0设计1对特异性鉴定引物：FAdV4-F：5′-C A A C T A C A T C G G G T T C A G G G-3′，FAdV-R：5′-G G T G G C G T T T C T C A G C A T-3′，扩增片段长度为958 bp。采用病毒基因组DNA提取试剂盒提取第4代病毒悬液的基因组DNA，并以其为模板进行PCR扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.7 病毒含量测定
采用1%胎牛血清的细胞培养液对病毒悬液进行10倍倍比稀释，取长满80% LMH细胞的96孔板，弃去培养液并用PBS缓冲液洗2次，然后每孔接入 100 μL 病毒稀释液，每个稀释度8孔，并设立正常细胞阴性对照。37 ℃孵育60 min，再加入1%胎牛血清的细胞培养液，37 ℃、5% CO2培养箱培养3～5 d。每日观察并记录病变情况，并用Reed-Muench法计算病毒含量。
1.8 Hexon基因的扩增及测序
参考GenBank中登录的FAdV-4的全基因组序列(登录号为MG856954.1)，采用Primer Premier 5.0设计了覆盖Hexon基因全部序列的引物：Hexon-F：5′-G T A T G T A T G T C G C G T T T C G-3′，Hexon-R：5′-G C A T C G C G T C G T A T T T A A-3′，扩增片段长度为3 144 bp。以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经电泳检测并回收。回收产物连接至pMD18-T载体，然后转化至DH5α感受态细胞。挑取单菌落振荡培养后用菌液进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌液送公司测序。
1.9 Hexon基因的遗传进化分析
将测序结果用DNAstar 7.1.0中的SeqMan进行拼接，得到的Hexon基因序列与GenBank数据库中的FAdV参考毒株进行BLAST比对，并使用MAGE X构建遗传进化树。
1.10 Fiber2基因的克隆
参考GenBank中登录的FAdV-4的Fiber2基因序列(登录号为HQ709232.1)设计扩增Fiber2基因的引物，并插入酶切位点，6×His标签和保护碱基，Fiber2-F：A T A T C T A G A A T G C T C C G G G C C C C T A A，Fiber2-R：C G C A A G C T T A T G A T G A T G A T G A T G A T G T T A C G G G A C G G A G G C，扩增片段长度为1 440 bp。以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳检测并回收。回收产物经限制酶HindⅢ和XbaⅠ酶切，并对酶切产物进行回收。
1.11 重组表达载体的构建
pNZ8148载体经限制酶HindⅢ和XbaⅠ酶切后，对酶切产物进行回收。pNZ8148载体酶切产物和Fiber2基因酶切产物用T4DNA连接酶在16 ℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌MC1061感受态细胞中，涂布于含氯霉素(10 μg/mL)的固体LB平板，37 ℃倒置培养16 h，挑取单菌落振荡培养后用菌液进行PCR鉴定。提取阳性菌液的质粒，双酶切鉴定，鉴定为阳性的质粒送公司测序，测序结果正确的重组质粒保存待用。
1.12 Fiber2蛋白的表达及鉴定
将构建的重组质粒pNZ8148-Fiber2电转化至乳酸菌NZ 9000感受态细胞并涂布于含氯霉素(10 μg/mL)的固体GM17平板，30 ℃倒置培养2～3 d。挑取单菌落于30 ℃静置培养后用菌液进行PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液按1 ∶100体积比接种于40 mL含氯霉素(10 μg/mL)的液体GM17培养基，30 ℃静置培养至菌液D600 nm达到0.4～0.6时，加入Nisin，使之终浓度为0、10、50、100 ng/mL，继续诱导培养 12 h。8 000 r/min离心15 min收集菌体沉淀，沉淀用PBS缓冲液洗2次后重悬，加入终浓度为 1 mg/mL 溶菌酶37 ℃孵育20 min。然后在超声波下裂解，4 ℃条件下12 000 r/min离心 20 min 后分别取上清和沉淀，沉淀用等量PBS缓冲液重悬，分别取 30 μL 加蛋白上样缓冲液煮沸后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白的表达方式。蛋白样经SDS-PAGE分析后转印到硝酸纤维素(NC)膜上，采用TBST溶液洗涤后，加入含5%脱脂奶粉的TBST溶液于室温封闭 2 h，采用一抗稀释液(6His-tag单克隆抗体，稀释比为1 ∶5 000)4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗涤后用二抗稀释液(HRP标记的羊抗鼠 IgG，稀释比 1 ∶2 500)室温孵育2 h，TBST洗涤后ECL显影观察。
2.1 病毒分离
由图1可知，将处理后的病毒悬液无菌接种到LMH细胞盲传至第3代96 h后出现明显的细胞病变，表现为细胞间隙变大、形态皱缩，而对照组细胞生长良好、形态正常，未出现细胞病变。
2.2 PCR鉴定
由图2可知，对鉴定引物扩增的DNA片段进行电泳检测，得到的片段大小为958 bp，与目的片段大小一致。
2.3 病毒含量测定
以5 d的观察结果为标准，通过计算得出第6代病毒的半数组织培养感染剂量(TCID50)为10-3.1/mL。
2.4 Hexon基因的扩增及测序
由图3可知，对扩增DNA片段进行电泳检测，结果得到3 144 bp大小的片段，与预期片段大小一致。经过克隆测序后，利用DNA Star对测序结果进行拼接，得到长度为2 814 bp的Hexon基因序列。
2.5 病毒Hexon基因的遗传进化分析
将测序后拼接得到的Hexon基因序列与GenBank数据库中的FAdV参考毒株进行BLAST比对，与FAdV-4同源性高达99.86%，说明成功分离了2株禽腺病毒4型，并分别命名为HBJZ2021A(病毒1)和HBJZ2021B(病毒2)。由图4可知，将Hexon基因序列与数据库中的34个 FAdV参考毒株的基因序列利用邻接(Neighbor-Joining)法序列比对后构建遗传进化树，发现HBJZ2021A株和HBJZ2021B株病毒的亲缘关系很近，处于同一小分支；
而与国内山东、浙江和北京等地区的毒株亲缘关系较近，处于同一分支；
与国外巴基斯坦、奥地利、墨西哥等国家的毒株亲缘关系较远，处于不同的分支。
2.6 Fiber2基因的扩增
由图5可知，以病毒全基因组为模板扩增的Fiber2基因产物，经电泳检测得到1 440 bp大小的片段，与预期片段大小一致。
2.7 重组表达载体的构建与鉴定
由图6可知，以随机挑取单菌落过夜培养的菌液为模板，采用pNZ8148载体的通用引物进行PCR扩增，提取阳性菌液的质粒，重组质粒经限制酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切，获得2条特异性条带。其中，一条为Fiber2基因片段(1 440 bp)，另一条为pNZ8148载体片段(3 167 bp)，与预期结果一致。重组质粒送公司测序，分析测序结果正确，表明成功构建了重组表达载体pNZ8148-Fiber2。
2.8 Fiber2蛋白的表达与鉴定
由图7可知，设置Nisin浓度梯度对重组质粒乳酸菌NZ 9000诱导表达，对诱导所得蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳检测， 约49 ku处出现1条特异性蛋白条带，与预期蛋白大小一致，重组Fiber2蛋白成功在上清液中表达，同时在Nisin诱导浓度为 50 ng/mL 时表达量最大。经Western-Blot鉴定，由图8可知， 结果显示在49 ku处出现1条特异性印迹，进一步说明Fiber2蛋白表达成功。
禽腺病毒在LMH细胞上能够稳定传代并增殖，且病毒含量高[16]。在对LMH细胞常规传代培养过程中发现，禽腺病毒不易贴壁、生长缓慢，参考ATCC官网上对LMH细胞培养方法的建议，采用 0.1% Gelatin溶液于4 ℃覆盖处理细胞瓶内壁的方法有助于其贴壁。
根据遗传进化树可知，国内禽腺病毒毒株多为4型，其他型主要分布在国外，HBJZ2021A株和HBJZ2021B株与国内山东、浙江、北京、四川、上海、江苏、黑龙江等地区的毒株亲缘关系较近，处于同一个分支上。这与我国Ⅰ群禽腺病毒主要以血清4型为主，呈散发性流行[17]有关。2015年，禽腺病毒4型于山东地区暴发，随后迅速传播至周边多个地区[16]。遗传进化树显示，国内以山东地区毒株报道最多，其他地区多为零散报道，同时，部分山东地区毒株与巴基斯坦、墨西哥和加拿大等国外毒株亲缘较近。这些侧面说明了禽腺病4型是从山东地区传入国内并传播至湖北地区的，为我国湖北地区禽腺病4型流行病学情况提供了理论依据。
乳酸菌是一类在自然界和生物体中广泛存在的革兰氏阳性细菌，有多个分属，是公认的绿色安全级微生物[18]。21世纪初，国内外学者致力于以乳酸菌作为基因工程受体菌对抗原、抗体、酶类、细胞因子等外源蛋白进行重组表达的研究[19-20]。乳酸菌可作为活载体疫苗菌株，具有以下突出优点：乳酸菌是无强抗原性的食品级菌种；
自身分泌蛋白较少，降低了对外源重组蛋白的干扰；
不会产生蛋白酶到胞外，使外源重组蛋白不易发生降解[21]。段欣强等将犬细小病毒VP2基因成功克隆至PMG36e载体，电转至乳酸菌MG1363，成功表达了VP2蛋白，该研究为乳酸菌表达系统成功表达病毒衣壳蛋白提供了依据[22]。Nisin可诱导含有nisI基因的乳酸菌表达系统，可提高外源蛋白的表达量，且诱导效率是无诱导的1 000倍以上[23]。试验采用不同浓度梯度Nisin对重组表达载体pNZ8148-Fiber2进行诱导，经SDS-PAGE电泳检测发现，加入Nisin可提高重组Fiber2蛋白的表达量，并且在Nisin诱导浓度为50 ng/mL时，表达量最大。本研究为禽腺病毒4型湖北地区的流行情况及其口服疫苗的开发提供了参考依据。