中藏药环烯醚萜生物合成途径及其关键酶研究
王路昊，路岳衡，耿贵工，许小宁，乔枫，2*
（1.青海师范大学青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁 810008；
2.青海师范大学高原科学与可持续发展研究院，青海 西宁 810008；
3.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016；
4.青海省农业项目指导服务中心，青海 西宁 810008）
环烯醚萜类化合物（Iridoids）是由琉蚁二醛（Iridodial）缩醛而成的一种单萜类化合物［1］。从化学结构来看，环烯醚萜的基本母核为环烯醚萜醇，具有环状烯醚、醇羟基等结构［2］，由于醇羟基性质活泼、不稳定，易于糖结合，故天然存在的环烯醚萜类化合物常与糖相连形成环烯醚萜苷类结构［3］。环烯醚萜具有环戊烷环烯醚萜和环戊烷开裂的裂环环烯醚萜两种基本骨架［4］，从结构来看，环烯醚萜可以分为以下三类：①环烯醚萜苷类，由C1的羟基与糖类结合而来，代表成分如京尼平苷、栀子苷，是山栀子（Gardenia jasminoides）中的主要药用成分，有清热泻火的作用［5］；
②裂环烯醚萜苷类，是环烯醚萜苷中环戊烷在C7-C8位处开环衍生而来［3］；
③4-位无取代环烯醚萜苷类，其与普通环烯醚萜苷的差异在于C4是否有取代基的存在，代表成分如地黄（Rehmannia glutinosa）中的梓醇，具有促进血管新生、降低血糖的功效［6］。
环烯醚萜类化合物最早是在蚂蚁的分泌腺中分离得到的［7］，但其在植物界之中分布极为广泛，如龙胆科（Gentianaceae）的秦艽（Gentiana macrophylla）［8］、川 西 獐 芽 菜（Swertia mussotii）［9］；
玄 参 科（Scrophulariaceae）的大花胡麻草（Centranthera grandiflora）［10］、地黄；
樟科（Lauraceae）中的山鸡椒（Litsea cubeba）［11］；
卫 矛 科（Celastraceae）的 雷 公 藤（Tripterygium wilfordii）［12］；
忍冬科（Caprifoliaceae）中的金银花（Lonicera japonica）［2］等双子叶植物之中，是许多中藏药的主要药用成分。近年来随着对该类化合物的深入研究，发现其具有多种生物活性，如唇形科（Lamiaceae）独一味（Lamiophlomis rotata）中的山栀苷甲酯和胡麻属苷等可以显著抑制神经末梢对疼痛的敏感性，具有良好的抗炎镇痛作用［13］；
玄参科胡黄连（Picrorhiza scrophulariiflora）中的胡黄连苷-1和胡黄连苷-2等能够稳定肝细胞膜、消除自由基，对于急性和亚急性肝炎造成的肝损伤进行保护，具有保肝利胆的作用［14］；
山茱萸科（Cornaceae）山茱萸（Cornus officinalis）中的莫诺苷和马钱苷可以降低血糖、对于心功能和血管损伤修复有明显功效，常被用来治疗糖尿病引起的心血管疾病［15］；
茜草科（Rubiaceae）鸡屎藤（Paederia scandens）中的鸡屎藤苷酸能够促进软骨细胞增殖、对IL-1β诱导的NO产生有显著的抑制效果，常被用来治疗风湿骨痛［16］；
龙胆科川西獐芽菜中的獐芽菜苦苷具有抗胆碱、保肝、镇静镇痛等功效，对胃肠道有解痉止痛的作用，常被用来治疗胃肠道疾病［17］。
近年来随着分子生物技术和生物化学等学科的发展，对环烯醚萜类化合物的活性成分及其生物合成途径研究也愈发深入，许多与其生物合成途径相关的关键基因也得到了克隆与分析。本文通过对环烯醚萜类化合物的生物合成途径及其相关酶方面进行综述，以便于其能够在工业、医药等行业中得到更好的开发与利用。
环烯醚萜类化合物的生物合成途径可以分为三个阶段（见图1）：前体的形成、萜类骨架的生物合成、后期的化学修饰。第一阶段由甲羟戊酸途径（Mevalonate pathway，MVA）和非甲羟戊酸途径又称2-甲基赤藓糖-4-磷酸途径（Methylerythritol 4-phosphate pathway，MEP）合成了反应的前体异戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸盐［18］。MVA途径主要存在于细胞质之中，因此又可以称为细胞质途径，是倍半萜、三萜等萜类化合物生物合成的主要途径。共有乙酰辅酶A酰基转移酶（Acetyl-CoA acetyltransferase，AACT）、羟甲 基戊二 酰 辅酶A合酶（Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase，HMGS）、甲基戊二酰辅酶A还原酶（Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、甲羟戊酸激酶（Mevalonate kinase，MK）、磷酸甲羟戊酸激酶（Phosphomevalonate kinase，PMK）、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶（Diphosphomevalonate decarboxylase，MVD）六 种 酶 参 与 反应［19］。MEP途径主要发生在质体中，是单萜、双萜等萜类化合物生物合成的主要途径。共有脱氧木桐糖-5-磷酸合酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS）、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶（2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase，CMS）、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激 酶（4-（Cytidine 5"-diphospho）-2-C-methyl-Derythritol kinase，CMK）、2-甲基赤藓糖-2，4-环二磷酸合酶（2-C-Methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate synthase，MCS）、羟甲基丁烯基-4-二磷酸合酶（4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase，HDS）、4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸还原酶（4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase，HDR）异戊烯二磷酸异构酶（Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase，IDI）八种酶参与反应［20］；
第二阶段是由这两个化合物在一系列酶的催化下形成环烯醚萜的骨架结构琉蚁二醛，共有香叶基焦磷酸合酶（Geranyl diphosphate synthase，GPPS）、香 叶 醇 合 酶（Geraniol synthase，GES）、香叶醇-10-羟化酶（Geraniol 10-hydroxylase，G10H）、10-羟基香叶醇氧化还原酶（10-Hydroxygeraniol oxidoreductase，10-HGO）、环烯醚萜合酶（Iridoid synthase，IS）五种酶参与反应［21］；
第三阶段是对萜类化合物进行各种化学修饰，目前对环烯醚萜的后期修饰途径尚不清楚，对裂环环烯醚萜的后期修饰途径研究更加深入。共有7-去氧番木鳖酸合成酶（7-Deoxyloganetic acid synthase，7-DLS）、7-去氧番木鳖酸葡萄糖基转移酶（7-Deoxyloganic acid glucosyltransferase，7-DLGT）、7-去氧马钱苷酸7-羟化酶（7-Deoxyloganic acid hydroxylase，7-DLH）马钱苷酸O-甲基转移酶（Loganic acid methyltransferase，LAMT）、裂环马钱苷合酶（Secologanin synthase，SLS）五种酶参与裂环环烯醚萜的后期修饰，最终生成裂环马钱子苷（Secologanin）。裂环马钱子苷是裂环环烯醚萜苷的骨架结构，最终可以在各种酶的作用下生成滇木樨榄苷、獐芽菜苦苷、秦艽苷A等裂环式环烯醚萜苷类化合物［22］。
图1 植物环烯醚萜类化合物代谢途径Fig.1 Plant iridoids metabolic pathway
在环烯醚萜类化合物前体合成的生物过程中有多种酶参与反应，其中HMGR、DXS、DXR、HDR与IDI这五种酶在该生物合成过程中具有重要作用，因此本文选取上述五个参与MVA和MEP途径的关键酶，以及与萜类骨架生物合成相关的酶（GPPS、GES、G10H、10-HGO、IS），对酶与相关功能基因表达的研究进行综述。
2.1 前体的形成
2.1.1 甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）
HMGR被视为MVA途径中最关键的限速酶，可以催化HMG-CoA转化为MVA。在拟南芥（Arabi-dopsis thaliana）植株中，HMGR1基因的缺失会导致其矮小、雄性不育［23］；
在人参（Panax ginseng）中加入洛伐他丁会导致不定根中的人参皂苷含量降低［24］，因此HMGR基因在MVA途径之中极为重要。根据王家典等［12］的研究，在雷公藤中HMGR基因的过表达，会导致雷公藤中雷公藤甲素的含量显著上升。这表明HMGR对植物中萜类物质代谢起着重要的调控作用，可以通过提高HMGR基因的表达量，来提高下游产物的积累量。
HMGR基因首次是从拟南芥分离得到，而后在丹参（Salvia miltiorrhiza）［25］、雷公藤［12］、滇龙胆（Gentiana rigescens）［26］等药用植物中被克隆出来。HMGR基因以多基因家族状态出现，含有至少两个以上的同源基因。如滇龙胆、丹参中存在两个；
青蒿（Artemisia caruifolia）中发现三个；
拟南芥中存在四个。根据周伟等［26］的研究，HMGR基因的表达具有时空特异性和组织特异性。在滇龙胆的根中，HMGR基因的表达量随着发育时期逐渐升高，在花期达到顶峰后，逐渐降低。在丹参中，HMGR基因表达在根中最高，在叶中最低，这与丹参酮的积累量相吻合［25］。
2.1.2 脱氧木桐糖-5-磷酸合酶（DXS）
DXS是MEP途径中的第一个限速酶，在植物萜类化合物的生物合成途径中起着重要作用，其可以催化一分子的丙酮酸与一分子的3-磷酸甘油醛缩合形成5-磷酸脱氧木酮糖。5-磷酸脱氧木酮糖是MEP途径中的第一个重要中间体，其可以影响植物次生代谢途径中萜类化合物的合成，因此可以通过调控DXS基因的表达量的高低，进而调控植物中萜类化合物的积累。根据杨林等［27］的研究，在甘草（Glycyrrhiza uralensis）中DXS基因的过表达会导致甘草酸含量的降低，这是因为在萜类前体的生物合成之中，有MEP和MVA两种合成途径，其中MEP途径主要合成单萜、双萜等萜类化合物，其是以3-磷酸甘油醛和丙酮酸为起始物。甘草酸属于三萜类化合物，主要由MVA途径合成，其是以乙酰辅酶A为起始物。DXS基因的过表达会导致丙酮酸和3-磷酸甘油醛的含量降低，不利于乙酰辅酶A的积累，从而使MVA途径受到抑制，令甘草酸含量降低。
DXS基因最早是从薄荷（Mentha canadensis）分离得到的，随后在滇龙胆［28］、丹参［29］、甘草［27］等植物中被分离出来。DXS基因可以分为三类：Ⅰ型基因与叶绿素等光合作用相关的萜类化合物生物合成有关；
Ⅱ型基因参与植物防御功能相关的萜类化合物的生物合成，如青蒿素；
Ⅲ型基因的功能目前研究较少，可能与某些萜类激素的生物合成有关［30］。根据杨滢［29］的研究，在丹参的茎中DXS1基因的表达量最高，在丹参的根中DXS2基因的表达量最高，推测DXS2基因在丹参的萜类物质生物合成调控中起重要作用。
2.1.3 5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶（DXR）
DXR基因最早是在大肠杆菌（Escherichia coli）中发现，目前已从雷公藤［31］、地黄［32］等多种植物中被分离出来并进行克隆分析。该基因通常是以单基因的状态出现，但在橡胶树（Hevea brasiliensis）内发现DXR基因也能以双基因的状态存在［33］。在MEP途径中，DXR作为第二个限速酶，作用是将DXP转 为MEP，而MEP是 合 成MEP途 径 终 产 物DMAPP和IPP的前体物质，因此DXR基因的表达水平对萜类化合物的生物合成起着重要的调控作用。根据朱畇昊等［34］的研究，在地黄中DXR基因在不同组织中的表达量与地黄的主要药效成分-梓醇在不同组织中的积累量呈正相关。
根据段文韬［35］的研究，DXR还可以作为靶点，进行新型抗生素的筛选研究。这主要是因为在大多微生物的萜类生物合成中，MEP途径是其唯一的合成途径，其中就包括许多人类致病微生物，如恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、肺炎杆菌（Streptococcus pneumoniae）等。因此在理论上具有抑制DXR活性作用的化学物质，就存在潜在的抑菌活性，能够筛选作为新型抗生素来使用。如鼠李素能通过与DXR的D150氨基酸通过氢键作用形成稳定的复合物，来抑制DXR的活性，进而治疗大肠杆菌诱导的败血症。
2.1.4 4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸还原酶（HDR）
HDR是MEP途径中的最后一个关键酶，其可以催化HMBPP转化为IPP和DMAPP。HDR基因目前已经从白花丹参［36］、黄花蒿（Artemisia annua）［37］、秦艽［38］等多种植物中相继克隆出来并进行分析。在白花丹参中过表达HDR基因，发现HDR基因的过表达会令丹参酮的积累量大幅增加［36］；
Botella-pavía等［39］通过对拟南芥进行转化，发现共转化过表达DXS基因和HDR基因的拟南芥，比单转化过表达DXS基因的拟南芥，紫杉二烯积累量高13倍。以上研究表明HDR基因是MEP途径中编码限速酶的关键基因，HDR基因的过表达以及与其它基因的共同表达均会提高下游产物的积累量［37］。
HDR基因的表达水平还存在组织差异性，在秦艽等植物的不同组织中，表达量具有很大差异。岑文等［38］对秦艽进行qRT-PCR分析，结果表明HDR基因在秦艽的根、茎、叶和花中均有表达，在花中的表达量最高，根中表达量其次，叶和茎中没有明显差异。但在丹参中HDR基因的表达模式与秦艽不同，其在叶中的表达量要显著高于根中的表达量，这可能与胡萝卜素等萜类化合物在不同植物组织器官中的积累量不同有关［36］。
2.1.5 异戊烯二磷酸异构酶（IDI）
IDI在MVA和MEP途径中均存在，其可以催化IPP和DMAPP相互转化，维持两者之间的比率。IPP和DMAPP的比率可以影响合成的下游产物的种类，当比率为1：1时合成单萜类化合物，当比率更高时将合成倍半萜、二萜或多萜类化合物，因此IDI是萜类生物合成途径中的关键限速酶［40］。
目前已经从灵芝（Ganoderma lucidum）［41］、川贝母（Fritillaria cirrhosa）［42］、滇龙胆［43］等植物中分离并克隆出IDI基因。根据目前的研究，IDI作为萜类生物合成途径中的关键基因，其过表达会导致下游产物含量增加。如在卷叶贝母鳞茎诱导的愈伤组织中过表达IDI基因，能有效提高卷叶贝母中生物碱含量［42］；
在杜仲（Eucommia ulmoides）中过表达IDI基因，会导致反式异戊二烯的合成增加；
在大肠杆菌中导入IDI基因，会使其番茄红素含量增加。IDI基因的表达还会受到内源和外源因素影响。在滇龙胆中，IDI基因在叶中表达量最高，茎内表达量最低［43］；
在川贝母中，IDI基因在鳞茎表达量最高，根中表达量最低［42］；
在灵芝中，茉莉酸甲酯会诱导IDI基因的表达量增加；
在麻风树（Jatropha curcas）中，高温干旱等逆境均会诱导IDI基因的表达量发生改变。
2.2 骨架的生物合成
2.2.1 香叶基焦磷酸合酶（GPPS）
GPPS可以催化IPP和DMAPP形成GPP。GPP是单萜类化合物合成的前体，也是后续化合物生合成的基础，因此GPPS是萜类化合物生物合成途径中的关键酶。GPPS在自然界中以同源和异源二聚体两种形式存在。其中同源二聚体以两个相同的亚基组成，主要存在于裸子植物和被子植物中。异源二聚体由一大一小两种亚基构成，目前仅在金鱼草（Antirrhinum majus）、山鸡椒等被子植物中被发现［32］。异源二聚体的大小两种亚基均属于异戊二烯蛋白转移酶家族成员，大亚基（GPPS.LSU）与香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS）的蛋白质序列相似性能达50%，小亚基（GPPS.SSU）仅有20%［11］。
GPPS基因目前已经从川西獐芽菜［9］、青叶胆（Swertia mileensis）［44］、山鸡椒［11］等植物中分离克隆出来，并进行分析。GPPS基因的表达与下游产物的积累量呈正相关。在川西獐芽菜中，GPPS基因在叶中表达量最高，与叶中环烯醚萜类化合物含量较高的结论相符合［9］。根据曹佩等［11］的研究，过表达GPPS基因，能够增加山鸡椒中单萜类化合物的量；
GPPS基因具有组织表达特异性。在地黄中，GPPS基因在叶片与块根中高表达，在叶柄中低表达［32］；
在青叶胆中，GPPS基因的表达量随发育时期增加而增加，在苗期最低，果期达到巅峰。GPPS基因的表达量还会受到外界因素的诱导。在青叶胆中，茉莉酸甲酯会诱导GPPS基因表达量逐渐增加，高盐环境会抑制GPPS基因的表达，适当的干旱胁迫也会增加GPPS基因表达量［44］。
2.2.2 香叶醇合酶（GES）
GES是单萜化合物生物合成途径中的关键限速酶，可以催化GPP生成香叶醇。香叶醇是一种直链单萜醇，也是大多药用及香料植物产生香味的主要化学成分。目前GES基因已经从四季桂（Osmanthus fragrans）［45］、蜘蛛香（Valeriana jatamansi）［46］、滇龙胆［47］、广藿香（Pogostemon cablin）［48］等植物中提取分离出来，并进行分析。研究发现GES基因的表达具备组织特异性和时空特异性。在四季桂中，GES基因在花和叶片等组织中均表达，花中的表达量要高于叶片，GES在花中的表达量会直接影响香叶醇的积累［45］；
在广藿香的叶中，GES在老叶中表达量最高，在嫩叶中表达量最低，而在广藿香的茎中，GES在各个时期的表达都很低或不表达［48］；
蜘蛛香中，GES在茎中表达量最高，在新生叶中表达量最低。GES表达量还会受到外界因素的刺激。滇龙胆和蜘蛛香中GES的表达均会受到茉莉酸甲酯的诱导。当蜘蛛香受到茉莉酸甲酯诱导后，GES表达会在48 h后达到最高，72 h后逐渐降低［46］。
2.2.3 香叶醇-10-羟化酶（G10H）
G10H是细胞色素P450单加氧酶家族中CYP76B亚家族的成员之一，也是环烯醚萜类化合物生物合成途径的关键酶［49］，具有催化香叶醇转变为10-羟基香叶醇的功能。目前G10H基因已经从广藿香［50］、秦艽［51］、蜘蛛香［49］等植物中分离克隆出来。G10H基因cDNA全长在1 533～1 662 bp，编码495～510个氨基酸，预测无跨膜或部分跨膜区域［22］。目前研究已证明G10H的表达量对于下游产物的积累具有重要的调节作用。在长春花（Catharanthus roseus）中G10H表达量与文多灵、长春质碱的总积累量呈显著正相关［52］；
在滇龙胆中G10H表达量与裂环烯醚萜积累呈正相关［47］；
在川西獐芽菜中过表达G10H基因，会令獐芽菜苦苷积累量增高［53］。G10H表达量还具有组织特异性，在广藿香中G10H在成熟叶中表达量最高，与川西獐芽菜G10H表达模式相似，但与滇龙胆、秦艽中G10H表达模式相差较远［50］。
2.2.4 10-羟基香叶醇氧化还原酶（10-HGO）
10-HGO是依赖NADPH的细胞色素P450单萜氧化酶，能够催化10-羟基香叶醇生成10-含氧香叶醛，成为合成下游产物裂环马钱子苷的原料，是裂环烯醚萜类化合物生物合成途径中的关键酶。目前10-HGO基因已经从地黄［32］、紫草（Lithospermum erythrorhizon）［54］、山栀子［55］等植物中提取分离出来。根据万云［54］的研究，在拟南芥中过表达硬紫草的10-HGO基因，会令细胞活跃程度增加、物质运输能力加强，推测10-HGO基因对紫草中紫草宁的生物合成有促进作用。根据刘文晓［32］的研究，10-HGO基因的表达量会因生长时期和组织器官不同而出现差异。在地黄根和茎中10-HGO6的表达量会随地黄的生长而降低，而在其叶中，10-HGO6的表达量随其生长而增加。
2.2.5 环烯醚萜合酶（IS）
IS环烯醚萜类化合物的生物合成的关键酶，是孕酮P5-β还原酶（P5βR）家族的成员。该酶与以香叶基焦磷酸为反应底物的单萜环化酶不同，其可以催化链状单萜10-含氧香叶醛先转化为烯醇化合物，再经Michael反应环化为环状单萜nepetalactol，nepetalactol是所有环烯醚萜苷类化合物的前体物质。
IS基因最早是从长春花中分离得到的，随后在地黄［56］、大花胡麻草［10］等植物中被克隆出来。IS基因的发现至关重要，其为通过生物技术手段，合成环烯醚萜类化合物提供了可能［57］。根据杨超飞等［56］的研究，IS基因的表达具有组织特异性，并会受到外源因素的影响。RgIS3基因在地黄的叶中表达量远高于其他组织，与地黄中环烯醚萜类成分积累量相一致，推测是地黄中环烯醚萜成分合成酶的主要编码基因。地黄的毛状根经茉莉酸甲酯诱导后，IS基因的表达呈先上升后降低的趋势，在12 h后到最高。在大花胡麻草中，IS基因在叶中表达量最高，其次是茎，在根中最低，在花中不表达［10］。
环烯醚萜类化合物是许多中藏药的主要药用成分，具有诸多生物活性，在工业、医药等行业中具有很高的应用价值。研究其代谢通路与关键酶及其编码基因，有助于调控代谢产物合成方向，培育目标成分含量较高的植株，对提高药材品质及产量具有重要的意义。
目前对于中藏药环烯醚萜类化合物生物合成途径，尤其是萜类修饰阶段相关的酶及其编码基因研究较少。此外，环烯醚萜类化合物的合成调控十分复杂，如底物的前馈调控、产物的反馈调控、多基因的联合作用等，因此还有许多调控机制尚未探明，对于特定性状调控的遗传机制亟待研究。随着分子生物学技术的不断发展，在未来的研究中通过结合转录组学、基因组学等方法，对相关酶及其编码基因的功能、结构与表达调控等方面进行深入研究，以此阐明环烯醚萜类化合物的合成调控与遗传机制，利用基因工程手段，提高中藏药中环烯醚萜类产物积累，为筛选高品质药材提供理论依据。
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