基于网络药理学探讨“酸枣仁-当归”药对治疗失眠的作用机制
丁匀乔，杨波*，彭海生，蒋蕾，张文远
(1.哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150028；
2.哈尔滨医科大学大庆校区，黑龙江 大庆 163319)
失眠(insomnia)是一种神经性的睡眠障碍类疾病，也是一种心理疾病[1]。中医上通常将失眠称为“不寐”，临床表现主要是难以入睡、醒后不易入睡、睡时易醒、彻夜难寐、多梦等[2]。长期失眠会造成精神不振、食欲减退、记忆力下降等，对人们的工作生活具有严重影响。若不及时治愈，会诱发焦虑不安、抑郁、恐惧急躁等精神紊乱等症状，对胃肠道、神经系统、内分泌系统、认知功能也具有严重影响，且会增加心血管类疾病及神经性疾病的发病率[3]。西医在治疗失眠上常用苯二氮卓类、巴比妥类等镇静催眠药，虽有明显疗效，但长期服用会产生耐受性、依赖性、停药反跳等不良反应[4]。中药主要是以清热去火、养心安神、滋阴补阳来治疗失眠且无不良反应、安全有效，故以中药治疗失眠成为一大趋势。
失眠的发病机制极其复杂，至今尚未有明确阐述。酸枣仁为鼠李科植物酸枣[ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou]的干燥成熟种子。甘、酸，平，归肝、胆、心经。可治疗失眠焦虑，达到养心安神、保护心脏的作用，酸枣仁中的总皂苷可抑制中枢神经兴奋，起到明显镇静催眠的作用[5]。当归为伞形科植物当归[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的干燥根。甘、辛，温。归肝、心、脾经。当归中的挥发油、有机酸、黄酮类等具有抗炎平喘、抗抑郁、强肾保肝、补气血等功效[6]。二者联用可起到补气养血、养心安神等作用。由于中药成分多、作用靶点多，传统的药理学方法难以阐明中药治疗疾病的复杂机理[7]。网络药理学作为一种近年来兴起的新技术，通过其大量的数据分析及多种数据库检索，可更为整体的探究药物与疾病之间的关系，预测其作用机制[8]，且符合中医理论，通过建立药物、靶点、途径和疾病的复杂网络来揭示药物的治疗机理。因此，许多研究人员利用网络药理学来探索中药的物质基础，预测中药的作用机理，同时运用分子对接模拟分子和蛋白质之间的几何结构和相互作用来探索分子在目标蛋白质结合位点的行为[9]，大大节省了实验时间。
有相关学者通过大量数据挖掘并分析总结发现，酸枣仁、当归单味用药频次较高，而“酸枣仁-当归”药对使用频次也较高，且具有良好的支持度与置信度[10]。目前尚无文章仅对“酸枣仁-当归”药对进行研究，故本文通过网络药理学及分子对接技术，构建成分-靶点及PPI网络图，对其潜在靶点进行预测并深入探讨该药对治疗失眠的作用机制。
1.1 “酸枣仁-当归”药对活性成分及靶点的收集 在中药系统药理学数据库TCMSP(https://tcmspw.com/)中分别以“酸枣仁”“当归”为关键词进行检索。以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且类药性(drug-likeness,DL)≥0.18为筛选条件进行筛选并汇总，得到药对的有效活性成分及相应靶点。在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中，选定已检索的物种为人类(Human)的基因下载，将有效活性成分的靶点转化成相应的基因名。
1.2 失眠靶点的筛选 通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以“Insomnia”为关键词进行检索，以Relevance score≥0.98为筛选条件，得到与失眠相关的疾病靶点。
1.3 “酸枣仁-当归”药对-活性成分-靶点网络图的构建 建立Excel表格对中药、活性成分及靶点进行自命名，导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“酸枣仁-当归”药对-活性成分-靶点网络图，并对其进行分析。
1.4 靶点蛋白互作网络图的构建 将最终得到的“酸枣仁-当归”药对靶点与失眠靶点导入韦恩图绘制软件Draw Venn Diagiam(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)生成韦恩图，得到“酸枣仁-当归”药对与疾病的交集靶点。将交集靶点上传至String数据库(https://string-db.org/)，设定条件为“Homo sapiens”，参数设定为>0.4，得到蛋白质互作(PPI)网络图。
1.5 GO功能富集与KEGG通路分析 利用R studio 1.4.1106软件对交集靶点进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)功能富集分析。基因本体富集分析包括生物过程(biological process,BP)、分子功能(cellular component,CC)、细胞组成(molecular functinn,MF)。以P<0.05为具有统计学意义。取富集数量排名前十的生物学过程及二十条通路进行绘图。并结合国内外文献筛选与失眠相关的通路进行分析。
1.6 分子对接 选取PPI网络图中degree值排名前五的靶点，通过RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)数据库下载对应的靶点蛋白，保存为PDB格式。在TCMSP数据库中下载“酸枣仁-当归”药对活性成分的结构，保存为mol2格式。通过Autodock软件对靶点蛋白进行去除水分子并加氢处理，将受体与配体进行分子对接，记录对接的分数进行评估，一般认为得分>4.25为有一定的结合活性，得分>5为结合活性较强，≥7为结合能力极强[11]。在PyMOL软件中对得分最高的成分靶点对接结果进行可视化。
2.1 “酸枣仁-当归”药对活性成分及靶点的筛选结果 通过TCMSP数据库筛选得到酸枣仁、当归中的活性成分共158个，其中酸枣仁33个，当归125个，经过OB≥30%且DL≥0.18为条件筛选后，得到活性成分11个，其中酸枣仁9个，当归2个，无相同成分。靶点共88个，其中酸枣仁40个，当归48个，删除重复靶点，最终“酸枣仁-当归”药对活性成分的靶点共50个。11个活性成分基本信息见表1。
表1 “酸枣仁-当归”药对活性成分基本信息
2.2 失眠相关靶点的收集 通过检索GeneCards数据库，获取失眠相关靶点共2 563个，经过Relevance score≥0.98为条件筛选后得到相关靶点1 348个。
2.3 “酸枣仁-当归”-活性成分-靶点网络图 将TCMSP数据库中筛选得到的2味中药、9个活性成分与50个相应靶点导入Cytoscape 3.7.2软件绘图，得到药对-活性成分-靶点网络图，其中2个成分未参与绘制(见图1)。图中可见节点共61个，边线共97条。其中黄色代表中药名称，粉色代表酸枣仁活性成分，紫色代表当归活性成分，蓝色代表靶点基因。连接度超过10的有4个活性成分，β-谷甾醇连接度最高，能与34个靶点相互作用，其次为乌药碱，与21个靶点相互作用，豆甾醇与14个靶点相互作用，齐墩果碱与11个靶点相互作用。β-谷甾醇、豆甾醇来源于当归，乌药碱、齐墩果碱来源于酸枣仁。
图1 “酸枣仁-当归”药对-活性成分-靶点网络图
2.4 靶点蛋白相互作用网络图的构建与筛选 将“2.1”项下得到的50个活性成分靶点与“2.2”项下得到的1 348个疾病靶点导入韦恩图绘制软件Draw Venn Diagiam，得到韦恩图(见图2)。从图中可得交集靶点20个。将交集靶点导入STRING数据库中生成PPI网络图(见图3)。图中可得交集靶点蛋白节点20个，相互作用边线76条，平均节点度为7.6，PPI富集P值为1.0×10-16,其中degree≥10的节点有6个，分别为乙酰胆碱酯酶(ACHE)、钠依赖性血清素转运蛋白(SLC6A4)、胺氧化酶[含黄素]A(MAOA)、钠依赖性多巴胺转运体(SLC6A3)、α-2A肾上腺素能受体(ADRA2A)、胺氧化酶[含黄素]B(MAOB)。可认为这6个靶点蛋白在PPI中互作明显，为酸枣仁-当归药对治疗失眠的核心靶点。
图2 “酸枣仁-当归”药对靶点与失眠相关靶点韦恩图
图3 潜在靶点蛋白相互作用网络图
2.5 GO功能富集与KEGG通路分析 通过R Studio软件对20个交集靶点蛋白进行GO功能富集和KEGG通路分析。得到GO条目503个(P<0.05)，其中生物过程(BP)396个，分子功能(CC)54个，细胞组成(MF)53个。分别选取富集基因数排名前十的条目绘图(见图4)。得到KEGG通路共33条(P<0.05)，根据富集基因数大小，选取前20条通路绘制气泡图(见图5)，图中圆点代表富集靶点数量，颜色越红，P值越小，可信度高。
图4 GO功能富集柱状图
图5 前20条KEGG通路气泡图
经分析得，GO富集中生物过程主要包括G蛋白偶联受体信号通路、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、肾上腺素能受体信号通路等；
分子功能主要包括突触前膜、突触后膜、膜茷等；
细胞组成主要包括G蛋白偶联胺受体活性、儿茶酚胺结合、神经递质受体的活动等。KEGG通路分析与文献调查得，涉及失眠的重要通路有神经活性配体受体相互作用、5-羟色胺能突触、多巴胺能突触、胆碱能突触、cAMP信号通路等。
2.6 分子对接结果分析 通过Autodock软件将酸枣当归药对的活性成分丁子香萜、β-谷甾醇、豆甾醇、美洲茶酸、乌药碱、胡萝卜甾醇、酸枣仁皂苷、植物甾醇、酸枣仁环肽、獐牙菜素、齐墩果碱与PPI网络图中得到的核心靶点SLC6A3、ADRA2A、ACHE、SLC6A4、MAOA、MAOB进行分子对接(对接结果评分表见2)。发现丁子香萜、乌药碱、酸枣仁皂苷、β-谷甾醇、豆甾醇、胡萝卜甾醇与6个核心靶点结合能力强。其中丁子香萜-MAOB、乌药碱-SLC6A4的结合能均<-9 kJ·mol-1。丁子香萜-MAOB结合能力最强，通过PyMOL软件对其对接结果进行可视化(见图6)。
表2 分子对接评分结果
图6 丁子香萜与MAOB对接结果图
失眠在人群中极为普遍，在过去的几年中，通过替代疗法改善患者的生理精神状态，提高患者的睡眠质量的方法愈发流行。通过对中药主要成分进行分析，研究其药理作用的方法越来越受到研究者的关注。将酸枣作为良药用于治疗失眠在中国已有两千余年的历史，酸枣仁作为中国传统中药之一，已鉴定出150多种化合物，包括萜类化合物，生物碱，类黄酮等，具有多种药理作用如镇静、催眠、抗炎和抗氧化等。水迷宫和跳台实验表明，酸枣仁还具有改善失眠大鼠学习和记忆能力的作用[12]。当归是一种传统的药用和食用植物，长期以来被用于补血、减轻疼痛、润滑肠道并治疗女性月经不调和闭经。近年来有文献表明其在治疗失眠方面也有一定的作用[13]。“酸枣仁-当归”药对有着非常有效的镇静催眠作用，但治疗失眠的具体机制尚不清楚，这限制了该药进一步的临床应用，本文通过借助网络药理学筛选潜在靶点，并通过分子对接的方法对可能的机制进行初步探讨。
在本研究中，通过研究网络药理学进行靶标预测，建立PPI蛋白互作网络，GO和KEGG富集分析和分子对接验证，讨论了“酸枣仁-当归”药对治疗失眠的可能机制。在筛选的“酸枣仁-当归”药对的有效成分中，植物甾醇具有神经调节作用，能够抑制乙酰胆碱酯酶活性[14]，β-谷甾醇已证明具有镇静、强心的作用，可以维持神经传导、镇静神经，平复情绪，改善睡眠不实。有资料表明[15]，酸枣仁中的总皂苷可明显阻断小鼠中枢神经兴奋，促使小鼠睡眠及提高其睡眠质量，并对神经递质、受体、失眠参数等也都具有调节作用，通过改善睡眠同时也达到抗抑郁、焦虑等作用，是酸枣仁产生镇静催眠作用最主要的成分[16]。张妍等[17]通过摇篮试验比较了酸枣仁皂苷和地西泮的镇静作用，指出酸枣仁皂苷的镇静作用比地西泮更稳定，更持久。Zhang等[18]研究得到酸枣仁皂苷对谷氨酸介导的海马兴奋性信号通路具有抑制作用，并且可能通过其抗钙调蛋白发挥作用。生物碱类不仅有镇静催眠的作用，还可通过调节免疫功能、影响炎症细胞因子和单胺类神经递质起到抗抑郁作用[19]。但乌药碱、齐墩果碱相关研究较少，尚不能说明具有镇静催眠作用，有待进一步探索。
在失眠疾病靶点与活性成分靶点相交的韦恩图中，我们得到了20个交集靶点，通过PPI蛋白互作网络我们得到了与失眠相关联了6个核心靶标，分别为乙酰胆碱酯酶(ACHE)、钠依赖性血清素转运蛋白(SLC6A4)、胺氧化酶[含黄素]A(MAOA)、钠依赖性多巴胺转运体(SLC6A3)、α-2A肾上腺素能受体(ADRA2A)、胺氧化酶[含黄素]B(MAOB)，这其中的大多数靶标与镇静催眠关系密切。其中，ACHE是一种丝氨酸蛋白酶，可将神经递质、乙酰胆碱水解为乙酸盐和胆碱，从而终止神经传递。Leung等[20]指出海马体中乙酰胆碱酯酶的丧失，证实了中隔的病变，表明海马中胆碱能传入物质的消耗在诱导和出现过程中均增加了对挥发性和可注射全身麻醉剂的催眠，固定和镇痛作用。SLC6A4为血清素转运蛋白，通过调节血清素能信号影响中枢神经系统，通常负责5-羟色胺(5-HT)再摄取，5-HT信号传导中断就会导致抑郁症，Lam等[21]认为SLC6A4的DNA甲基化与晚期抑郁症之间的基因型相关联。目前有很多抗抑郁药具有镇静安定作用，如氟西汀、舍曲林。因此我们推断SLC6A4可能具有镇静作用从而治疗失眠。ADRA2A属于G蛋白偶联受体超家族成员，介导低血压、镇静催眠、麻醉等多种生理效应[22]，ADRA2A的基因多态性可以通过促进miR-34a与ADRA2A的结合从而影响患者的睡眠质量[23]。
KEGG富集结果表明，“酸枣仁-当归”药对治疗失眠可能与神经活性配体-受体相互作用，钙信号通路，5-HT能通路，多巴胺能突触，心肌细胞的肾上腺素能信号转导，胆碱能突触等通路有关。据调查[24]，神经活性配体-受体相互作用为首选治疗通路，促进觉醒/抑制睡眠的物质(如：儿茶酚胺)和促进睡眠/抑制觉醒的物质(如：5-HT、褪黑素)等皆由此通路发挥作用；
研究表明，下丘脑中5-HT和多巴胺为调节睡眠-觉醒的重要神经递质[25]，5-HT又名血清素，脑内5-HT水平的降低，不仅会导致失眠、焦虑、抑郁等疾病，还会影响其他神经递质活动。GO富集结果表明，调节突触后膜电位的神经递质受体活性、肾上腺素能受体结合、突触膜的整体成分、G蛋白偶联受体信号通路起到了重要的作用。综上，我们得出了“酸枣仁-当归”药对治疗失眠的可能机制。我们推测，“酸枣仁-当归”药对可能通过MAOB、ACHE、SLC6A4、ADRA2A等靶标通过调控G蛋白偶联受体、胆碱能突触、多巴胺能突触、钙信号通路，5-HT能信号通路来起到多信号通路共同影响其治疗失眠的作用，多信号通路和多靶标的共同作用体现了中药治疗疾病过程中作用复杂，综合调理的特点。
本文旨在通过网络药理学和分子对接等方法进行靶标预测和初步探讨“酸枣仁-当归”药对治疗失眠的几种潜在机制，体现了中药通过多成分、多靶点、多途径治疗疾病的特点，并未对具体的信号通路进行进一步深入的探索，通路的具体调控过程有待实验研究进一步验证。
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