基于PI3K/Akt/FoxO3a信号通路探讨壮骨止痛胶囊防治肌少－骨质疏松症的作用机制
桑继亮，杨岩冰，马江涛，3，柴爽，3，叶茂林
（1.河南省开封市第二中医院，河南 开封 475000；
2.河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院），河南 郑州 450046；
3.广州中医药大学，广东 广州 510405）
肌少－骨质疏松症（osteosarcopenia，OS）［1］是一种肌少症（sarcopenia，SP）与骨质疏松症（osteoporosis，OP）并存的老年综合征，患者表现为肌量、肌力和肌肉功能下降，同时骨量和骨密度下降。SP 引起的跌倒与OP 引起的脆性骨折相互叠加，易导致患者骨折、残疾和虚弱状态的发生，其发病率和病死率远高于SP 或OP［2-3］。然而目前有关本病的基础研究较少，尚无统一的用于基础研究的动物模型构建方法，临床实践中也没有同时靶向SP 和OP 的有效治疗药物［4］。网络药理学系统可整合疾病数据库、药物数据库等现有资源，预测药物作用的潜在靶点及通路，为成分复杂、作用广泛的中药复方研究及常见病、罕见病机制研究提供理论预测［5-6］。
OS 属“痿证”范畴，病位在脾、肾。肾主骨，脾主肉，脾肾失调则“骨肉不相亲”“骨枯肉痿”，故发为本病，治法以补肾健脾为主［7-8］。壮骨止痛胶囊由补骨脂、淫羊藿、枸杞子、女贞子、骨碎补、狗脊和牛膝组成，具有滋补肝肾、壮骨止痛的功效。壮骨止痛胶囊可明显改善去势大鼠骨形成标志物［9-10］，但其对SP、OS 作用的相关研究尚未见报道。本研究首先基于网络药理学方法预测壮骨止痛胶囊防治OS 的作用机制，然后通过构建OS 动物模型，验证壮骨止痛胶囊防治OS 的效果及作用机制，为研究OS 的发病机制、动物OS 模型构建和药物治疗提供新的思路与方法。
1.1 数据库与分析平台
采用TCMSP数据库（https：//tcmsp－e.com/）、BATMAN－TCM 数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman－tcm/） 、GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM数据库（https：//www.omim.org/）、UniProt知识库（https：//www.uniprot.org/）、Bioconductor数据库（https：//www.bioconductor.org/，版本3.14）、STRING（https：//string－db.org/，版本11.5）、Perl 软件（Perl 5，版本30）、R软件（版本3.6.3）和Cytoscape软件（版本3.7.2）进行预测及分析。
1.2 实验动物
健康雌性SPF 级6月龄Sparague Dawley（SD）大鼠60 只，广州中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK（粤）2018－0034。实验在广州中医药大学动物实验中心SPF 级实验室进行，温度（23 ± 3）℃，湿度（50 ± 10）%，每天光照12 h。实验经过广州中医药大学实验动物伦理委员会批准。
1.3 主要药品与试剂
地塞米松磷酸钠注射液（三才石岐制药股份有限公司，批号：20190350）；
注射用青霉素钠（山东鲁抗医药股份有限公司，批号：190405）；
戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号：523A）；
壮骨止痛胶囊（四川美大康药业股份有限公司，批号：190601）。
Western 及IP 细胞裂解液、SDS－PAGE 凝胶配制试剂盒、电泳液及转膜液等（Beyotime）；
抗PI3K 抗体（批号：4257，CST）；
抗磷酸化Akt 抗体（批号：4060，CST）；
抗Akt 抗体（批号：4691，CST）；
抗磷酸化FoxO3a抗体（批号：9666，CST）；
抗GAPDH 抗体（批号：5174，CST）；
HRP标记的羊抗兔IgG抗体（批号：0074430102，武汉爱博泰克）。
1.4 主要仪器
电子秤；
大鼠抓力仪（YLS－13A型，济南益延科技发展有限公司）；
双能X 线骨密度仪（Discovery A 型，美国Hologic 公司）；
micro CT 仪（比利时Scanco Medical）；
电泳仪/转膜仪（美国Bio－Rad 公司）；
凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。
2.1 壮骨止痛胶囊防治OS的网络药理学研究
2.1.1 壮骨止痛胶囊有效成分的筛选及靶点预测
首先检索TCMSP 数据库和BATMAN－TCM 数据库中补骨脂、淫羊藿、枸杞子、女贞子、骨碎补、狗脊和牛膝的活性成分，根据口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥ 30%和药物类药性（drug likeness，DL）≥0.18［11］筛选活性成分及其对应靶点。然后采用Perl 软件和UniProt 知识库为筛选出的靶点添加基因名。
2.1.2 OS的靶点筛选
以“osteoporosis”“sarcopenia”“osteosarcopenia”为关键词，采用GeneCards数据库和OMIM 数据库检索并筛选OP、SP 和OS 疾病相关靶点，将所得OP 靶点与SP 靶点取交集，并与检索到的OS 靶点取并集得到OS相关的所有靶点。
2.1.3 壮骨止痛胶囊活性成分－交集靶点调控网络构建
将壮骨止痛胶囊活性成分靶点与OS 靶点进行一一映射，得到中药－疾病的交集靶点，然后利用网络图像化软件Cytoscape，构建活性成分－交集靶点调控网络。其中节点表示活性成分或靶点，边表示活性成分与靶点之间的关系。
2.1.4 PPI网络的构建及核心靶点筛选
将中药－疾病的交集靶点导入STRING 在线网站，设置研究物种为人，最小互作分数值为最高置信度0.9，其余参数保持默认设置，输出结果。借助Cytoscape 的插件CytoNCA 对PPI 网络进行拓扑学分析，根据度自由性（Degree，DC）＞61 和介度中心性（Betweenness，BC）＞600筛选关键靶点［12］。
2.1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
将交集靶点导入R 软件，限定物种为“智人”，P＜0.05 为阈值，采用Bioconductor 生物信息软件包进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。
2.1.6 KEGG调控网络构建
利用Perl 软件将交集靶点和富集最明显的前20 个KEGG 通路进行一一映射，并采用网络图像化软件Cytoscape构建交集靶点－KEGG通路。其中节点表示交集靶点或KEGG 通路，边表示交集靶点与KEGG通路之间的关系。
2.2 壮骨止痛胶囊防治OS的动物实验研究
2.2.1 分组、造模及给药
将60 只SPF 级SD 大鼠按体质量依据随机数字表随机分为5 组，即正常组（Control 组）、假手术组（Sham组）、OS 组、OS 壮骨止痛胶囊组（OS + ZGZT 组）和OS雌二醇组（OS + E2组）。其中OS 组、OS + ZGZT 组和OS+E2组大鼠采用去势法造模，Sham组采用假手术造模。除Control 组外，其余各组大鼠术后均每日肌内注射青霉素钠8万单位/只，连续3 d。术后恢复1周，1周后开始对OS组、OS+ZGZT 组和OS+E2组大鼠行地塞米松磷酸钠注射液（DXM）1 mg/（kg·d）腹腔注射，连续2 周。造模结束后，开始药物干预，按照大鼠用药量=人每天用药量/60×6.25，将壮骨止痛胶囊（5.4 g）和戊酸雌二醇片（1 mg）分别于研钵内研磨，生理盐水溶解。Control组、Sham组和OS组大鼠每天灌胃10 mL/kg生理盐水，OS+ZGZT 组每天灌胃0.562 5 g/kg 壮骨止痛胶囊溶液，OS + E2组每天灌胃0.104 mg/kg 戊酸雌二醇片溶液，连续用药3个月。
2.2.2 大鼠一般情况观察
每天观察并记录各组大鼠的摄食活动、精神状态及异常行为等。干预结束后，电子秤测量各组大鼠体质量。
2.2.3 大鼠前肢抓力检测
干预结束后，测量各组大鼠前肢抓力（forelimb grip strength）。测量时，将大鼠轻放在抓力仪上，抓住大鼠尾巴水平缓慢向后拉，确定大鼠前肢抓牢横杆后肢离开横杆时，平稳向后拉，直到大鼠前肢无法抓住横杆，记录仪器上的瞬时最大抓力值，测量3 次取平均值，作为反映前肢肌肉力量的指标。
2.2.4 大鼠骨密度、骨骼肌量检测
取材前，麻醉大鼠，用双能X线骨密度仪测量大鼠全身骨密度（bone mineral density，BMD）、腰椎BMD、全身骨骼肌量（lean mass，LM）和四肢骨骼肌量（appendicular lean mass，ALM），并计算大鼠骨骼肌质量指数（SMI，LM/BW）和四肢骨骼肌质量指数（RSMI，ALM/BW）。
2.2.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测PI3K、p－Akt、Akt和p－FoxO3a蛋白表达水平
取冻存的腓肠肌，液氮下研磨粉碎，裂解液裂解，提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度，蛋白样品变性。配制凝胶，电泳，转膜，封闭。依次加入PI3K（1∶1 000）、p－Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p－FoxO3a（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次15 min。HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体室温孵育1 h，TBST 洗涤3 次，每次15 min。利用全能型凝胶成像系统显影，并采用Image J 1.52a 软件定量分析蛋白条带。
2.3 统计学分析
数据分析采用SPSS 20.0 软件，计量资料采用均数± 标准差（±s）表示。所有数据先进行正态性与方差齐性检验。若方差齐，组间两两比较采用LSD法，多组间比较采用单因素方差分析。若方差不齐，采用Dunnett"s T3（3）法。P＜0.05 代表差异有统计学意义。
3.1 网络药理学
3.1.1 有效成分的筛选及靶点预测结果
筛选得到活性成分89 个，靶点1 580 个。其中补骨脂活性成分3 个，对应靶点52 个；
牛膝活性成分4 个，对应靶点188 个；
狗脊活性成分2 个，对应靶点3 个；
枸杞子活性成分35 个，对应靶点322 个；
骨碎补活性成分15 个，对应靶点263 个；
女贞子活性成分9 个，对应靶点307 个；
淫羊藿活性成分21 个，对应靶点445个。
3.1.2 OS的靶点筛选结果
以“osteoporosis”“sarcopenia”“osteosarcopenia”为关键词，采用GeneCards数据库和OMIM 数据库检索并筛选与OP、SP 和OS 疾病相关的靶点，得到4 091个OP相关靶点，200个SP相关靶点和1个OS相关靶点。将4 091 个OP 相关靶点与200 个SP 相关靶点取交集，得到124 个交集靶点，见图1。并与检索到的1 个OS 靶点取并集后得到OS相关靶点125个。
图1 OP与SP交集靶点的韦恩图
3.1.3 调控网络构建结果
将OS 疾病靶点与壮骨止痛胶囊中活性成分对应的靶点取交集后得到18个交集靶点，对应24个活性成分。其中，补骨脂2 个，牛膝1 个，枸杞子1 个，骨碎补5个，女贞子2个，淫羊藿10个，多味药3个。见图2。
图2 壮骨止痛胶囊－肌少－骨质疏松症－靶点调控网络
3.1.4 靶点蛋白互作网络（PPI）构建及核心靶点筛选结果
采用PPI 网络使交集靶点可视化。为了进一步筛选关键靶点，利用Cytoscape 软件的CytoNCA 插件进行网络拓扑分析。当DC ＞61，BC ＞600 时，得到56 个节点和734 条边。可见壮骨止痛胶囊可能影响与OP 相关的56个基因，而这56个基因之间直接或间接的作用高达734种。见图3、图4。
图3 蛋白相互作用网络（PPI）
图4 中药－疾病关键靶点筛选策略
3.1.5 GO和KEGG富集分析结果
GO 功能富集分析主要包括3 个部分，即生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。壮骨止痛胶囊防治OS的作用主要与类固醇结合、类固醇激素受体活性、生长因子活性、整合素结合、胰岛素样生长因子（IGF）受体结合和胰岛素受体（ER）结合等相关。富集比较明显的KEGG 通路包括内分泌抵抗、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、FoxO 信号通路、PI3K/Akt 信号通路、催乳素信号通路、生长激素合成分泌和作用信号通路、雌激素信号通路以及表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药性等。见图5、图6。
图5 壮骨止痛胶囊防治肌少－骨质疏松症的GO功能富集分析
图6 壮骨止痛胶囊防治肌少－骨质疏松症的KEGG通路富集分析
3.1.6 KEGG关系网络构建结果
KEGG关系网络构建结果中红色椭圆代表基因，绿色菱形代表KEGG通路；
邻接节点数目越多，图形越大，作用越大，见图7。
图7 壮骨止痛胶囊防治肌少－骨质疏松症的基因－通路调控网络
16 个交集基因可通过调节20 个通路来影响OS 的发生，见表1。其中，胰岛素样生长因子－1（IGF－1）、细胞间黏附分子－1（ICAM1）、FOS、雌激素受体1（ESR1）、雌激素受体2（ESR2）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素－6（IL－6）和胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）等基因作用较大。
表1 KEGG通路富集结果
3.2 壮骨止痛胶囊防治OS的动物实验研究结果
3.2.1 各组大鼠一般情况观察
实验过程中，Sham 组大鼠因术后伤口裂开感染死亡1 只，OS + ZGZT 组大鼠因灌胃误吸死亡2 只，最终纳入研究的动物数量为57只。
3.2.2 各组大鼠体质量及骨密度比较
干预结束后，各组大鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）；
与Control 组和Sham 组相比，OS 组大鼠全身BMD 和腰椎BMD 明显下降（P＜0.05）；
与OS 组相比，OS+ZGZT 组大鼠全身BMD 和腰椎BMD 明显增加（P＜0.05）。表明壮骨止痛胶囊可明显改善OS大鼠骨密度，防治OP。见图8。
图8 各组大鼠体质量及骨密度比较
3.2.3 各组大鼠前肢抓力、SMI和RSMI比较
与Control组和Sham组比较，OS组大鼠前肢抓力有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），SMI和RSMI则明显下降（P＜0.05）；
与OS组比较，OS+ZGZT组大鼠前肢抓力、SMI和RSMI明显增加。表明壮骨止痛胶囊可明显改善OS大鼠前肢抓力和骨骼肌量，防治SP。见图9。
图9 各组大鼠前肢抓力、SMI和RSMI比较
3.2.4 各组大鼠腓肠肌PI3K/Akt/FoxO3a 信号通路相关蛋白表达比较
与Control组和Sham组比较，OS组大鼠腓肠肌PI3K和p－FoxO3a 蛋白表达明显增加；
与OS 组相比，OS +ZGZT组大鼠腓肠肌PI3K、p－Akt和p－FoxO3a蛋白表达显著增加。表明壮骨止痛胶囊可能通过上调PI3K/Akt/FoxO3a信号通路相关蛋白表达来防治OS。见图10。
图10 各组大鼠腓肠肌PI3K/Akt/FoxO3a信号通路相关蛋白表达比较
目前临床对于OS的发病机制、诊断标准及治疗方法尚未达成共识，OS 的基础研究还处于萌芽阶段［4］，然而OS 引起的跌倒、脆性骨折、虚弱等不良健康结局较单一的OP 或SP 更为严重［2-3］。因此迫切需要结合现有的OS 临床研究及基础研究，建立OS 的诊断标准及动物模型，为OS的基础研究和临床研究提供研究载体及理论依据。壮骨止痛胶囊防治OP 效果显著［9-10］，但能否防治OS 尚属未知。本研究基于网络药理学方法预测壮骨止痛胶囊防治OS的作用机制，进而通过构建OS动物模型验证壮骨止痛胶囊防治OS的效果和作用机制，为OS 的诊断标准、模型构建和药物治疗提供参考依据。
OS 的诊断包括OP 和SP两个方面。OP 的诊断以WHO 推荐的DXA 测量的骨密度T 值为依据，即“-2.5 ＜T 值＜-1”诊断为骨量减少，“T 值≤-2.5”诊断为骨质疏松症，“T值≤-2.5且伴一处或多处脆性骨折”诊断为严重骨质疏松症［13］。而SP 的诊断则尚有争议［14］，欧洲肌少症工作组（EWGSOP）、国际肌少症工作组（IWGS）、美国国立卫生院基金会（FNIH）和亚洲肌少症工作组（AWGS）分别制定了各自的诊断标准。虽然诊断标准众多，但基本均包括对肌力、肌量和肌肉功能的评估。肌力测量以优势手握力为主，肌量测量以骨骼肌质量指数（全身骨骼肌质量/身高2）和四肢骨骼肌质量指数（四肢骨骼肌质量/身高2）为主，肌肉功能测量以步速为主。
目前鲜有OS动物模型构建的报道，已报道的研究或利用老龄去势大鼠［15］或利用转基因衰老型小鼠［16］来模拟OS表型。这些研究虽然为OS动物模型的构建提供了参考，但也存在造模周期长、造模成本高、模型不稳定、可重复性差、可比性差等严重问题，难以大面积推广应用。结合课题组前期研究［11，17-18］，本研究动物实验部分利用6月龄SD 雌性大鼠去势结合DXM 腹腔注射造模的方法，然后分别灌胃壮骨止痛胶囊和雌激素3 个月，最后以大鼠全身BMD 和腰椎BMD、前肢抓力、大鼠SMI 和RSMI 为OS 评价标准，并对网络药理学预测出的PI3K/Akt/FoxO3a信号通路进行验证。结果，本研究不仅成功构建OS大鼠模型，而且证明壮骨止痛胶囊可能通过上调PI3K/Akt/FoxO3a 信号通路相关蛋白表达来防治OS。
网络药理学研究表明，壮骨止痛胶囊防治OS的关键通路有内分泌抵抗、TNF 信号通路、FoxO 信号通路和PI3K/Akt 信号通路等，笔者对网络药理学预测出的FoxO 信号通路和PI3K/Akt 信号通路在动物实验部分进行分子验证。动物实验研究结果显示，与Control 组和Sham 组相比，OS 组大鼠全身BMD、腰椎BMD、SMI和RSMI 明显降低，表明去势联合DXM 可导致大鼠发生OS。与OS 组相比，OS+ZGZT 组大鼠全身BMD、腰椎BMD、前肢抓力、SMI和RSMI明显增加，表明壮骨止痛胶囊可明显改善OS 大鼠BMD、肌力和肌量，防治OS。此外，壮骨止痛胶囊明显提高了OS 大鼠腓肠肌中PI3K、p－Akt 和p－FoxO3a 蛋白表达水平，表明壮骨止痛胶囊防治OS 的作用可能与上调PI3K/Akt/FoxO3a信号通路相关蛋白表达有关。
本研究基于网络药理学方法预测壮骨止痛胶囊防治OS的作用机制，发现壮骨止痛胶囊防治OS的关键通路主要有内分泌抵抗、TNF信号通路、FoxO信号通路和PI3K/Akt信号通路等。进而通过构建OS大鼠模型验证壮骨止痛胶囊防治OS的效果及作用机制，发现去势联合DXM可以构建OS动物模型，壮骨止痛胶囊可通过上调PI3K/Akt/FoxO3a 信号通路来改善大鼠全身及腰椎BMD、前肢抓力、SMI 和RSMI 等，为OS 的动物模型构建、评价标准确定和药物选择提供新的思路和方法。
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