宁夏固原部分地区肉犊牛呼吸道6种病原流行病学调查
郭亚男，杨春莲，谢文青，赵永红，摆世林，梁小军
(1.宁夏农林科学院 动物科学研究所，银川750002；
2.固原市畜牧技术推广服务中心，宁夏 固原 756000；
3.海原县畜牧产业发展服务中心，宁夏 海原 755299；
4.海原县国有林场和草原建设服务中心，宁夏 海原 755299；
5.宁夏向丰农牧业开发有限公司，宁夏 西吉756200)
目前在我国经济水平不断向前发展的大背景下，大规模牛养殖产业得到进一步发展，已经成为基层地区农民群众发家致富的一种主要途径。然而随着养殖规模不断扩大，养殖密度不断增加，面临的病毒性、细菌性、寄生虫性等疾病愈来愈多，给养殖场造成的损失也越来越多，直接威胁到养殖场种群的稳定和扩繁，进而影响养牛产业的经济效益。
在养殖中新生犊牛常见的传染性疾病，主要包括消化道疾病和呼吸系统疾病[1]。因新生犊牛适应环境的能力不足，免疫系统不够强大，呼吸道疾病成为犊牛养殖中的棘手问题，该疾病病因复杂，传染性强，且具有一定的潜伏期，不易被发现，对肉牛养殖产业造成较大经济损失，因此通过对疾病流行情况的检测和诊断，对疾病的防治尤为重要[2-4]。牛呼吸道疾病通常由多种病原体混合感染导致，包括病毒、细菌、支原体，常见的病原主要包括支原体、结核杆菌、巴氏杆菌、呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎、牛副流感病毒、牛病毒性腹泻病毒等[5]。呼吸道疾病在养殖场中发病相对较高，一旦发生流行，将会对整个养殖产业造成严重的威胁。随着牛养殖产业不断向前推进，单一病原引发的牛呼吸道疾病的发生率呈现逐年下降趋势，表现为多种病原混合感染继发感染，使患病病例的临床症状不断向复杂化方向转变，给疾病的诊断和防控工作带来很多困难[6]。
本研究采用病原分子诊断技术，针对固原2个肉牛养殖区开展为期3年的犊牛呼吸道疾病流行病学调查，旨在掌握目前犊牛呼吸道疾病的发病及流行情况，为针对性的实施疾病防控措施提供科学依据。
1.1 主要材料
RNAiso Plus、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、Premix TaqTM、DL2000TMMarker等均购自TaKaRa公司；
RNA专用氯仿、RNA专用75%乙醇、异丙醇等购自上海生工公司。细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；
胶回收试剂盒，购自OMEGA公司D2500-01。
1.2 引物设计和合成
采用宁夏农林科学院动物科学研究所动物疫病研究室前期已建立的牛多病原PCR诊断技术方法。不同病原引物序列均由上海生工合成。
2.1 样品采集
用无菌长棉签采集患牛鼻腔深部分泌物置于装有2 mL灭菌生理盐水中试管中，冷藏条件下保存。固原市杨坪村2019—2021年共计采集呼吸道鼻拭子661份，其中2019年共采集犊牛呼吸道样品182份；
2020年共采集犊牛呼吸道样品204份；
2021年共采集犊牛呼吸道样品275份。固原市马沟村2019—2021年共计采集呼吸道鼻拭子736份，其中2019年共采集犊牛呼吸道样品224份；
2020年共采集犊牛呼吸道样品250份；
2021年共采集犊牛呼吸道样品262份。
2.2 DNA/RNA提取
DNA提取：采集鼻拭子的试管使用旋涡振荡仪振荡1 min后，12 000 r/min离心2 min，使用细菌基因组DNA提取试剂盒对菌体沉淀进行基因组DNA的提取，-80 ℃保存。
RNA提取：采集鼻拭子的试管使用旋涡振荡仪振荡1 min后，3 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清12 000 r/min离心30 min，离心后取弃上清，收集沉淀用于RNA提取。根据RNA提取试剂盒(RNAiso Plus)操作程序对处理样本RNA进行提取。根据PrimescriptTM反转录试剂盒操作程序将提取的总RNA反转录为cDNA，-80 ℃保存。
2.3 PCR扩增及序列分析
不同病原体PCR引物和退火温度如表1所示。PCR反应体系为25 μL体系：2×Taq Mix 12.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板2 μL，去离子水9.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min、95 ℃变性30 s、退火温度见表1。20 s、72 ℃延伸1 min，35个循环；
72 ℃延伸8 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
表1 不同病原体引物序列、退火温度及产物长度
2.4 统计分析
采用不同软件处理数据，用Excel软件进行数据整合，采用SAS软件中的卡方检验进行差异性分析。
3.1 不同年份犊牛呼吸道系统疾病发情情况统计结果
2019—2021年杨坪村犊牛呼吸系统疾病发病率呈下降趋势，但不同年份间差异不显著(P>0.05)。2019年，杨坪村犊牛呼吸系统性疾病发病率为27.37%；
2020年，犊牛呼吸系统性疾病发病率为26.84%；
2021年，犊牛呼吸系统性疾病发病率为24.12%(表2)。
2019—2021年马沟村犊牛呼吸系统疾病发病率呈下降趋势，2021年与2019年相比差异显著(P<0.05)。2019年，杨坪村犊牛呼吸系统性疾病发病率为26.20%；
2020年，犊牛呼吸系统性疾病发病率为21.93%；
2021年，犊牛呼吸系统性疾病发病率为19.70%(表2)。
表2 2019—2021年犊牛呼吸道疾病发病率统计
2.2 犊牛呼吸道疾病6种病原检测结果
通过提取呼吸道鼻拭子样品DNA和RNA，并采用特异性引物进行6种病原分子生物学诊断，结果发现，杨坪村2019—2021年6种病原平均阳性率呈下降趋势，但不同年份间差异不显著(P>0.05)。2019年检测的6种病原中，平均阳性率为18.97%，牛支原体感染率最高，为45.05%；
其次是牛病毒性腹泻病毒阳性率达24.73%，牛传染性鼻气管炎病毒阳性率达21.98%，多杀性巴氏杆菌阳性率达10.99%，其他2种病原在7%以下。2020年检测的6种病原中，平均阳性率为18.79%，主要以牛支原体和巴氏杆菌为主。牛支原体感染率最高，为59.80%，其次多杀性巴氏杆菌阳性率达29.41%，其他4种病原阳性率均低于7%。2021年检测的6种病原中，平均阳性率为17.21%，主要以牛支原体和巴氏杆菌为主。牛支原体感染率最高，为45.09%，其次是多杀性巴氏杆菌阳性率达33.45%，其他病原在8%以下(表3)。
表3 杨坪村6种病原发病情况
马沟村2019—2021年6种病原平均阳性率呈下降趋势，但不同年份间差异不显著(P>0.05)。2019年检测的6种病原中，平均阳性率21.95%，牛支原体感染率最高，为53.57%；
其次是多杀性巴氏杆菌阳性率达41.07%，牛病毒性腹泻病毒阳性率达24.73%，其他3种病原在9%以下。2020年检测的6种病原中，平均阳性率为21.00%，牛支原体感染率最高，为59.80%；
其次是多杀性巴氏杆菌阳性率达33.60%，牛病毒性腹泻病毒阳性率达13.60%，其他3种病原在10%以下。2021年检测的6种病原中，平均阳性率为17.24%，牛支原体感染率最高，为61.07%，其次是多杀性巴氏杆菌阳性率达22.90%，其他病原在7%以下(表4)。
表4 马沟村6种病原发病情况
通过对宁夏固原地区2个示范村杨坪村和马沟村肉犊牛呼吸道疾病发病情况和6种常发病原的鉴定开展为期3年的追踪调查。2019—2021年间犊牛呼吸道病毒性疾病发病率逐年减少，原因可能是由于近年来病毒性疫苗的使用，尤其是牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒疫苗的推广使用明显抑制了这两种疾病的发生，同时也证明疫苗可以作为预防疾病的首要手段；
而牛支原体和多杀性巴氏杆菌阳性率占比较大，牛支原体目前美国已经有商品化的疫苗，但是成本较高，免疫效果没有数据可作参考，国内目前没有牛支原体的疫苗[7]，犊牛也可通过接触被感染的母牛或者被牛支原体污染的牛乳而造成感染，多杀性巴氏杆菌目前无可用的商品化疫苗而造成病原的广泛存在。当生活环境、饲料、气温、运输等诱因存在后，致使犊牛免疫力降低也会使犊牛感染牛支原体病和多杀性巴氏杆菌病[8]，造成犊牛呼吸系统疾病。各种病原感染后犊牛表现的临床症状没有特异性，病程刚开始时，犊牛的临床表现并不明显，因此就需要临床经验丰富的工作人员及早发现，及早治疗。
通过对6种病原的鉴定和流行情况追踪，揭示了宁夏固原地区犊牛目前存在多种呼吸道病原感染情况，不同养殖场疾病发病情况和病原发病比例不同，但均存在本研究中的6种病原体。研究还发现，注射过疫苗的犊牛发病率逐年降低，因此疫苗可以预防动物疾病的发生，但是牛支原体和多杀性巴氏杆菌的疫苗国内没有商品化的产品，这也为科研人员提供了今后的努力方向。由于没有科学有效的疫苗预防疾病，发病后只能使用多种不同种类的抗生素治疗疾病，因此准确诊断疾病发生的原因，并给出科学的治疗方案十分重要。在养殖过程中，负责人员应注重犊牛健康培育，从饲养管理、营养、疫病的预防、疾病的早期诊断和治疗等方面建立一套适合本养殖场环境的犊牛培育及健康养殖技术体系，进而减少犊牛疾病的发病率和死淘率，保证基层肉牛养殖高效、健康发展[1,9]；
基层兽医工作者也要经常参加培训，提高自身的理论知识，在工作中才能更早更准确的诊断出使何种疾病，对症下药，科学严谨的用药也可以降低病原的耐药性[10]。
本研究对2019—2021年固原2个肉牛养殖区造成犊牛呼吸道疾病6种主要病原的发病率开展病原学研究。2019—2021年杨坪村犊牛呼吸系统疾病发病率呈下降趋势，但不同年份间差异不显著(P>0.05)；
马沟村犊牛呼吸系统疾病发病率呈下降趋势，2021年与2019年相比差异显著(P<0.05)。2019—2021年，病毒性呼吸道疾病呈下降趋势，而牛支原体和多杀性巴氏杆菌由于没有有效的疫苗预防而呈现较高的阳性率。牛支原体和多杀性巴氏杆菌为目前犊牛主要的呼吸道致病病原，做好牛支原体病和多杀性巴氏杆菌病的预防、早期诊断和治疗可有效降低犊牛呼吸道疾病的发病率。