日本对虾miR-34靶基因预测及其生物信息学分析
李 粉,刘新鹤,高铭悦,徐 晨,徐俊颖,史莹华,崔亚垒
(河南农业大学动物科技学院,河南 郑州 450046)
MicroRNA是一类～22 nt的内源性非编码小RNA,可以调控蛋白编码基因-massenger RNA(mRNA)的表达[1]. miRNA的转录一般由RNA聚合酶II(RNA Pol II)来执行,并受到RNA Pol II相关转录因子及表观遗传的调控[2-3]. 初级miRNA(pirmary microRNA)在RNA Pol II的作用下被转录下来后,经过一系列的加工过程形成成熟的miRNA. 产生的具有双链结构的RNA(miRNA:miRNA*)组装到Argonaute(Ago)蛋白上形成沉默复合体前体,并瞬时发生解链,miRNA*链被解离下来,形成成熟的沉默复合体,发挥基因沉默的效应[4-5].
MiRNA在水生动物中的相关研究越来越多,鲤鱼脾脏中保守miRNA的靶基因预测结果显示,这些miRNA与免疫系统发育、先天性和获得性免疫应答及细胞因子生成等诸多免疫过程相关[6]. Dang等[7]发现miR-155在鱼类细胞系中能很好地协助细胞抑制真鲷虹彩病毒的复制,且通过抗病毒因子IFN及相关通路来诱导抗病毒反应. 此外,研究表明,miRNA主要通过miRNA的种子序列(一般从5′端开始第2到第7个碱基)与mRNA的3′UTR(3′非编码区)区域有连续的Watson-Crick碱基配对[8]. 而miRNA的种子序列可以与约1/3的人类基因碱基配对,说明了miRNA调控范围的广泛性[8]. 在乳腺癌中miR-9可以通过调控6个基因的表达来抑制乳腺癌细胞的增值、入侵,并诱导细胞发生凋亡[9];miR-125b至少可以靶向于10条基因,影响人神经系统的发育[10];miR-34可作为乳腺癌抑制因子调控多个基因的表达,引起细胞周期阻滞和削弱细胞迁移能力[11-13]. 据之前的报道,miR-34在肿瘤细胞中可促使Caspase-3的裂解,诱发Caspase调控的凋亡途径[14],还可通过被p53激活,抑制肿瘤细胞的增殖与生长,促进肿瘤细胞凋亡[15]. 由此可见miR-34可以参与细胞凋亡、细胞增殖、细胞迁移等多个细胞过程. 此外,一些miRNA在进化过程中具有高度保守性. 例如,let-7在脊椎动物、节肢动物和蛔虫中的序列都是相同的[16];在病毒与宿主的相互作用中,病毒编码的miRNA与人的miRNA具有高度同源性[17-18];有的miRNA在不同物种间其种子序列是一致的[19]. 已有研究表明,对虾Argonaut(Ago)复合体中宿主及病毒编码的miRNA、mRNA在病毒感染不同时间段呈现差异表达,且日本对虾编码的miRNA在病毒感染前后靶向基因的数量发生变化[20]. 也有研究报道,日本对虾miR-34(mja-miRNA-34)作用于白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)编码的基因[21],但mja-miRNA-34对宿主基因的调控及其参与的信号通路还有待进一步研究. 本研究根据日本对虾miR-34靶基因的预测结果,通过数据整合和生物信息学分析方法的应用,挖掘可能的理论结果,并对结果进行系统分析和整理. 该结果可为mja-miR-34靶基因的实验鉴定及其生物学功能的研究提供数据支持和理论指导.
1.1 材料
mja-miRNA-34:根据日本对虾Ago复合体miRNA、mRNA测序数据[20],获得了mja-miR-34.
不同物种的miR-34:搜索miRBase(http://www.mirbase.org/)可获得不同动物的miR-34的成熟序列.
日本对虾基因的3′UTR:分析获得日本对虾Ago复合体mRNA数据库,从该数据库中获得对虾基因的3′UTR[20]. 根据对虾基因的3′UTR进行后续的mja-miR-34的靶基因预测.
1.2 方法
1.2.1 miR-34的靶基因预测
采用TargetScan 5.1和miRanda预测miR-34的靶基因. TargetScan 5.1根据miR-34 的种子序列,搜索对虾基因3′UTR上的靶位点. miRanda软件根据miRNA的全序列搜索可能的靶基因. miRNA与靶基因相互作用的条件为自由能<-20 kcal/mol,分值>50. 两种预测软件获得的序列的交集,则有可能是miR-34的靶基因.
1.2.2 mja-miR-34的Northern blot分析
按照mirVana miRNA isolation kit说明书(Ambion,USA),提取RNA. 利用NanoDrop ND-1000 spectrophotometer进行浓度及质量鉴定. 用制备的15%变性聚丙烯酰胺凝胶(含有8M尿素)进行RNA电泳分离. 把分离后的RNA转印至Hybond-N+膜上(Amersham Biosciences,Buckinghamshire,UK),1200 J紫外交联30 s. 用Detection Buffer稀释NBT/BCIP显色底物,并把配制好的显色液加入平皿中进行显色. 待目的条带清楚后,弃去显色液终止显色. mja-miR-34地高辛标记的探针序列为5′-ACAACCAGCTAACCACACTGCCA-3′;U6地高辛标记的探针序列为5′-GGGCCATGCTAATCTTCTCTGTATCGTT-3′.
1.2.3 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是用特异性引物序列检测日本对虾体内miR-34的靶基因(serine/threoninekinase3、translationinitiationfactor、cytidinedeaminase)的表达. 本试验收集未注射WSSV(0 h)和注射WSSV(24 h、36 h、48 h、72 h)日本对虾的鳃、血淋巴细胞. 用Spin Column Animal Total RNA Purification Kit(Sangon Biotech,China)提取RNA. 以RNA为模板,通过Rever Tra AceTMqPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Takara,Japan)试剂盒进行反转录反应,合成cDNA. 以日本对虾β-actin(β-actin正向引物:5′-CGAGCACGGCATCGTTACTA-3′,β-actin反向引物:5′-TTGTAGAAAGTGTGATGCCAGATCT-3′)作为内参基因. miR-34靶基因的引物序列为serine/threoninekinase3正向引物5′-GTAAAGGCTCAAAGGATAAC-3′,serine/threoninekinase3反向引物5′-TGCTGTGTAACAATGGG-3′;translationinitiationfactor正向引物 5′-CTCGGAGAAACTGCTTGA-3′,translationinitiationfactor反向引物5′-GGTAGAGACCCTCCTTGG-3′;cytidinedeaminase正向引物5′-TGCAGAGATGGGAGAGAGGT-3′,cytidinedeaminase反向引物5′-TCAGGTAGTAGTTTGCCGACG-3′. 制备总体积为20 μL,其中包含10 μL的ChamQ Universal EYBR qPCR Master MIX(Vazyme,China),0.5 μL的cDNA模板,10 μmol/L 0.4 μL的正向和反向引物,并用无菌水加至 20 μL. 进行PCR扩增. 反应程序:95 ℃预变性3 min;40次循环:95 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s.
1.2.4 mja-miR34在对虾体内的过表达
在对虾尾节第四节注射WSSV(104个 WSSV粒子)和30 μg miR-34或miR-34-scrambled的模拟物. 注射36 h后,利用实时荧光定量PCR分析miR-34预测靶基因的表达量. miR-34模拟物Sense序列5′-UGGCAGUGUGGUUAGCUGGUUGU-3′,Antisense序列5′-ACAACCAGCUAACCACACUGCCA-3′;miR-34-scrambled的Sense序列5′-AUUUGACAGAUGCCUAGUACCAG-3′,Antisense序列5′-CUGGUACUAGGCAUCUGUCAAAU-3′.
1.2.5 GO分析和KEGG分析
TargetScan及miRanda软件预测得到的靶基因与GO数据库进行比对,E<1e-5. 获得匹配度最高的GO的ID,并描述这些基因和基因产物的属性. 对得到的靶基因进行KEGG Pathway分析,利用KAAS预测得到对应的KO号,分析基因与KEGG中酶注释的关系文件以及映射到pathway的信息.
1.2.6 数据分析
使用IBM SPSS Statistics 26中的比较平均值,对数据进行单因素ANONA检验,用邓肯法进行事后多重比较,用(平均值±标准误)表示结果. 小写字母表示差异显著(P<0.05).
2.1 miR-34的保守性
由表1可知,日本对虾编码的miR-34(mja-miR-34)在人、鼠、果蝇等17个物种的成熟序列具有高度相似性,说明mja-miR-34在物种进化过程中具有高度保守性.
表1 不同物种的miR-34的成熟序列Table 1 Mature sequences of miR-34 in different species
2.2 mja-miR-34靶基因的预测
白斑综合症病毒感染日本对虾0 h、24 h、48 h后,收取对虾血淋巴细胞,提取对虾Ago1-RNA 复合体中的RNA,进行RNA高通量测序[20]. 以RNA高通量测序得到的转录组数据为数据库,用TargetScan及miRanda预测mja-miR-34的靶基因,选取两种软件靶基因预测结果的交集,共得到242个mja-miR-34的靶基因(表2). Northern blot结果显示mja-miR-34在病毒感染不同时间段呈现差异表达(图1A);同时,转录组数据显示mja-miR-34的靶基因在病毒感染不同时间段呈现差异表达(图1B-F),说明mja-miR-34及其靶基因可能参与病毒感染进程. 随机挑选3个miR-34的靶基因进行表达量分析,结果表明,miR-34靶基因的差异表达情况与测序结果一致(图1G-I).
表2 TargetScan及miRanda软件预测的miR-34靶基因Table 2 miR-34 targeted genes predicted by TargetScan and miRanda software
续表2 Table 2 continued
续表2 Table 2 continued
A:mja-miR-34的靶基因在病毒感染不同时间段的表达量. B-F:TargetScan及miRanda软件预测的靶基因及其在病毒感染不同时间段的差异表达情况. G-I:实时荧光定量PCR检测miR-34靶基因在病毒感染不同时间段(0 h、24 h、36 h、48 h)的差异表达情况. 柱形图小写字母表示差异显著(P<0.05).
2.3 mja-miR-34靶基因的GO分析
对242个靶基因进行GO功能富集分析,结果显示,在生物学过程层面上mja-miR-34靶基因显著富集在细胞过程、代谢过程、单一有机体过程、生物调节等条目中;在细胞成分层面上,靶基因显著富集在细胞、细胞部分、细胞器、膜等条目中;在分子功能层面上,靶基因显著富集在粘合物、催化活性、分子传感活性、信号转换器活性等条目中(图2). 这些结果说明了mja-miR-34参与对虾体内多种生物学过程及细胞功能.
图2 mja-miR-34预测靶基因的GO注释分析Fig.2 GO annotation analysis of mja-miR-34 predicted target genes
2.4 mja-miR-34靶基因的KEGG分析
在GO注释分析基础上,利用现有的生物通路数据,对基因集合中的242个基因进行生物通路富集分析. 结果显示,mja-miR-34的靶基因大多参与碳水化合物代谢、细胞信号转导、运输和分解代谢等细胞过程,免疫系统、疾病感染及遗传信息的折叠、筛选、降解等通路中(图3A). 并且富集程度排名前20的信号通路中显著富集在嘧啶代谢通路、赖氨酸降解通路、嘌呤代谢通路和果糖/甘露糖代谢等通路中(图3B). KEGG分析结果表明,mja-miR-34参与细胞代谢、细胞信号转导、免疫系统以及遗传信息的调控等.
图3 mja-miR-34预测靶基因的通路分析Fig.3 Pathway analysis of predicted target genes of mja-miR-34
2.5 mja-miR-34靶基因的初步分析
为研究mja-miR-34对其预测靶基因的调控作用,研究利用mja-miR-34的模拟物在对虾体内过表达mja-miR-34,并利用实时荧光定量PCR分析serine/threoninekinase3、translationinitiationfactor基因的表达量. 结果表明,mja-miR-34过表达后serine/threoninekinase3基因的表达量与WSSV组、WSSV+miR-34-scrambled组无显著差异,而translationinitiationfactor基因的表达量显著降低(图4),说明serine/threoninekinase3不是mjmiR-34直接作用的靶基因,而mja-miR-34可调控translationinitiationfactor基因的表达.
A:mja-miR-34对serine/threonine kinase 3基因表达量的影响. B:mja-miR-34对translation initiation factor基因表达量的影响. 小写字母表示差异显著(P<0.05).图4 mja-miR-34过表达后,其预测靶基因的表达情况分析Fig.4 Expression analysis of predicted target genes of mja-miR-34 after overexpression of mja-miR-34
miRNA种子区,也就是miRNA 5′端中能与靶基因的3′端UTR区完全互补的第2～7位碱基序列[8]. miRNA在不同物种间具有高度保守性,例如miR-150[22]、miR-504[23]、miR-652[24]、miR-497[25]等. 不同物种间miR-34的序列显示,miR-34在不同物种间也具有高度保守性. “种子序列”的高度保守性可能反映了miR-34在物种进化过程中一直发挥着重要作用.
miRNA作为基因表达的理想工具,可以在不同程度上同时调控多个靶基因表达. miR-155在肿瘤中通过调控SK1、CLDN-1、SMAD2等发挥抑癌作用[26]. 在乳腺癌中miR-132-3p可以通过调控N-cadherin、Vimentin、Snail和E-cadherin的表达抑制乳腺癌上皮间质转化[27]. miR-1290通过调控SMEK1[28]、NKD1[29]和LHX6[30]等基因对肿瘤起作用. Huh7.5.1细胞感染JFH-1病毒24 h后,miR-122的靶基因SREBF1、FASN和ACACA相对表达量低于未感染JFH-1病毒的Huh7.5.1细胞,而感染48 h、72 h、96 h后,miR-122靶基因SREBF1、FASN和ACACA的相对表达量升高并且高于未感染JFH-1病毒的Huh7.5.1细胞[31]. BHK-21细胞感染BEFV病毒24 h、48 h后,miR-3470b的表达量上升,miR-3470b的靶基因MAVS表达量呈负相关[32]. 本研究结果也表明,mja-miR-34及其靶基因在病毒感染不同时间段呈现差异表达的趋势.
目前miR-34靶基因的研究和验证大多集中在高等动物中. 在人类中miR-34的靶基因有OCT4[33]、DLL1[34]、SATB2[35]、IGFBP-3[36]等. 在褐飞虱中miR-34的靶基因有NllnR1和NllnR2[37]. 在家蚕中miR-34的靶基因有BmE74和BmCPG4[38]. 在小鼠中,miR-34a可控制肥胖,主要通过代谢途径调控[39]. 关于小儿淋巴癌病症研究发现,miR-34a表达过量可使小儿淋巴癌症状缓解,主要与DKK1和WIF-1基因有关[40]. 本研究结果表明,mja-miR-34可能靶向作用于对虾编码的242个宿主基因. mja-miR-34的靶基因参与细胞代谢、细胞信号转导、免疫系统以及遗传信息的调控. mja-miR-34与其预测靶基因的初步分析表明miR-34真正调控的靶基因还有待进一步探索. 本研究为mja-miR-34功能的进一步研究与完善提供了理论基础和研究方向,有助于进一步解释mja-miR-34在宿主病毒互作中的作用,为对虾养殖业中WSSV病毒的预防提供新的靶点.
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