1株无花果活性内生细菌对PEG-6000胁迫培养小麦幼苗生理特征的影响
王 鹏，鲁明会，邵梓涵，彭 洋，李正芹，普丽玲，李淑英
(玉溪师范学院化学生物与环境学院， 云南 玉溪 653100)
小麦是我国重要的粮食作物之一，其生长受较多因素影响。干旱是小麦生长过程中最常见的逆境因素，影响小麦产量与品质，小麦在胁迫条件下的抗旱机理非常复杂。接种不同微生物对植物抗逆性提高有明显效果，赵慧云等[1]通过断水模拟干旱胁迫，研究根围促生菌菌剂(枯草芽孢杆菌AR菌株、枯草芽孢杆SM菌株、枯草芽孢杆XY菌株和菌株合剂)处理对小麦幼幼苗抗旱性的生理机制。结果表明：在干旱胁迫条件下，经不同根围促生菌处理的小麦幼苗根冠比、叶片相对含水量、叶绿素含量、脯氨酸含量和根系活力均显著高于对照 (CK1和CK2)，相对电导率和丙二醛含量显著低于对照，说明在干旱胁迫下，接种不同根围促生菌可增强小麦幼苗耐旱性，不同根围促生菌诱导小麦幼苗抗旱能力有差异。植物内生菌的应用在植物抗逆性方面也有较多研究和成果[2-4]，植物内生菌(Endophytes)包括内生真菌、内生细菌和放线菌，是一类新型微生物资源，在农业和医药业上有潜在应用价值，活性内生菌次生代谢产物具有丰富的化学结构多样性和广泛的生物活性，能够促进植物生长，提高植物对生物胁迫和非生物胁迫抗性等[5]。刘军生等[6]从杠柳和草木樨分离，筛选出具有较高镉抗性的内生细菌进行16S rDNA序列分析，对其Cd2+去除率、吲哚乙酸(IAA)活性、铁载体活性和1-氨基环丙烷-1-�人�(ACC)脱氨酶活性等生物学特性进行研究，利用盆栽试验验证了杠柳和草木樨的内生细菌能提高小麦幼苗耐镉胁迫的能力。王军卫等[7]通过在外源脱水应答转录因子DREB基因在转基因小麦中的诱导型表达与抗干旱生理效果研究中，通过测定转基因组与非转基因组叶片脯氨酸含量可知，有16个转基因株系的脯氨酸含量与非转基因对照相比，脯氨酸含量增加相当显著，其中10个株系的脯氨酸含量在1 100 μg·g-1以上，比对照提高了2倍多，利用逆境诱导型启动子(rd29B)可以增强外源DREB基因的表达，能显著改良小麦的抗旱性。通过生物方法来改变植物生理生化指标，从而提高小麦抗旱性已成为一个研究的热点。
本研究以小麦幼苗作为试验材料，水培条件下采用PEG-6000模拟干旱[8]胁迫培养，水培过程中接种从无花果浆汁中筛选到的1株活性内生细菌Bacillusstrain(BF3252)。在接种无花果浆汁中的活性内生细菌的条件下，通过测定小麦幼苗叶片中的丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白质(SP)和可溶性糖(SS)等生理生化指标变化，探究活性内生细菌BF3252对模拟干旱(PEG-6000)胁迫条件下对小麦生长的缓解作用。本研究旨在研究无花果活性内生细菌对模拟干旱条件下小麦抗逆性的影响以及胁迫条件下抗逆性的研究机制，为内生细菌与植物抗逆性的关系提供了新的理论依据以及相关研究内容。
1.1 试验材料
小麦种子：济麦22号。内生细菌：BacillusstrainBF3252，无花果浆汁内分离得到，可产生活性成分为芽孢杆菌，芽孢形成时间为26 h。菌株：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，湖北保藏中心购买；
大肠杆菌Escherichiacoli及变形杆菌P.vulgaris，本校微生物实验室保存。
1.2 培养基
LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌30 min后35℃恒温无菌检查24 h后备用。
发酵培养基：黄豆粉10 g，甘露醇10 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.5。
1.3 试验设计
1.3.1小麦种子培养 取干净的白瓷盘洗净放置晾干备用，选取籽粒饱满、完整有胚、无霉变的小麦种子，用8%次氯酸钠溶液消毒30 min，然后浸泡12 h后播种，待小麦幼苗至10 cm左右(3～4 d)，用不同浓度PEG-6000模拟干旱胁迫培养及接种OD值≈1的BF3252悬菌液：
CK(加蒸馏水)、加入BF3252菌悬液、加入20%PEG-6000、20%PEG-6000+BF3252菌悬液、加入30%PEG-6000、30%PEG-6000+BF3252菌悬液，加入量均为300 mL，1个对照和5个试验组。试验采用20%PEG-6000与30%PEG-6000进行模拟干旱培养比较适宜[9]。从胁迫培养7 d开始测定SS、SP、Pro和MDA含量，每隔7 d测定1次，共测定3次，小麦幼苗培养周期为25 d左右。
1.3.2菌悬液的制备 在无菌操作台用接种环将内生菌接种到LB培养基中，置于120 r·min-130℃振荡培养1～2 d后测内生菌OD值，OD值≈1时可用于培养小麦。
1.3.3无花果活性内生细菌BF3252活性成分测定 采用牛津杯琼脂扩散法检测内生细菌的抑菌效果：将BF3252接种到发酵培养基中(接种量为3%)，37℃ 120 r·min-1摇床培养48 h。取活化好的3株指示菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌)制成相应菌悬液，作为指示菌来测定无花果内生细菌的抑菌效果。每株分别取 0.5 mL，采用倾注法与培养基混合凝固后倒置37℃培养24 h，将有菌平板分成3个区域，分别用口径与牛津杯大小相似的打孔器在培养基3个区域打3个孔，将孔中的培养基弃去，加上牛津杯。取发酵培养基中上层液体置于无菌离心管中，在4 000 r·min-1下离心30 min，用微量移液器吸取上清液200 uL置于牛津杯内，每株3个平行，37℃培养48 h后测量抑菌圈大小。
1.3.2小麦叶片生理特征测定 可溶性糖(SS)含量采用3，5-二硝基水杨酸法测定[10]，波长520 nm；
标准曲线为y=1.614 7x+0.015 5，R2=0.994 5。可溶性蛋白质(SP)含量采用考马斯亮蓝法[11]测定，波长595 nm；
标准曲线为y=0.214x-0.000 3，R2=0.995 2。脯氨酸(Pro)含量采用磺基水杨酸法[12]提取及测定小麦叶片脯氨酸，波长520 nm；
标准曲线为：y=0.081 4x-0.010 7，R2=0.994 4。丙二醛(MDA)含量采用双组分分光光度法测定，具体过程及计算参照文献[12]进行，略做调整。
2.1 内生细菌BF3252代谢产物对3株指示菌的抑菌效果
从表1可知，内生细菌BF3252产生的活性成分对3株指示菌生长均有一定的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌抑菌效果较好，对大肠杆菌和变形杆菌生长也有抑制作用，说明BF3252的代谢产物中可以产生抗菌活性成分。
表1 BF3252对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及变形杆菌的抑菌活性
2.2 接种BF3252对PEG-6000胁迫培养小麦幼苗可溶性糖(SS)含量的影响
可溶性糖是植物体内抵御干旱环境的一种重要渗透调节物质。从图1可知，小麦幼苗叶片可溶性糖含量在加入PEG-6000和BF3252后呈现增加趋势，培养至21 d时加入PEG-6000小麦幼苗中SS含量增加明显，小麦幼苗中SS分别增加了248.36%(20%PEG-6000)、275.65%(30%PEG-6000)，说明PEG-6000模拟干旱胁迫对小麦的生长有较大影响；
接入BF3252对小麦幼苗SS含量也有一定影响，胁迫培养至7、14、21 d时小麦幼苗中SS含量均高于CK，外源BF3252加入对小麦生长有影响。在加入PEG-6000同时接入BF3252菌悬液后小麦幼苗的SS含量提高，说明BF3252对小麦幼苗渗透调节物质可溶性糖具有调节作用，也说明BF3252对小麦幼苗生长具有缓解作用，修复作用在7 d时分别为31.78%(20%PEG-6000)和13.03%(30%PEG-6000)，14 d时分别为11.73%(20%PEG-6000)和5.42%(30%PEG-6000)，21 d时分别为4.45%(20%PEG-6000)和4.16%(30%PEG-6000)，表明BF3252对小麦幼苗的修复作用随培养时间延长逐渐减弱，同时受PEG-6000胁迫浓度的影响，在PEG-6000浓度较低时(20%PEG-6000)BF3252的修复作用相对较强。
图1 PEG-6000胁迫培养小麦叶片可溶性糖含量变化
2.3 接种BF3252对PEG-6000胁迫培养小麦幼苗可溶性蛋白质(SP)含量的影响
蛋白质是生命的物质基础，植物在逆境条件下通过可溶性蛋白合成的增加，直接参与其适应逆境的过程。从图4可知，CK组和接种了BF3252后小麦幼苗叶片中SP含量随培养时间的延长呈现增加趋势；
PEG-6000胁迫培养及PEG-6000胁迫培养过程中接种BF3252小麦幼苗叶片中的SP含量均低于CK和接种BF3252试验组，可能与模拟胁迫培养所用PEG-6000浓度有关，本研究发现接种BF3252试验组SP含量略高于PEG-6000胁迫试验组，说明BF3252对小麦幼苗的生长具有调节作用，BF3252对提高小麦幼苗的抗性有一定作用，20%PEG-6000胁迫条件下修复效果为1.47%(7 d)、1.00%(14 d)、1.06%(21 d)；
30%PEG-6000胁迫条件下修复效果为0.97%(7 d)、0.65%(14 d)、1.49%(21 d)。
图2 PEG-6000胁迫培养小麦叶片可溶性蛋白质含量变化
2.4 接种BF3252对PEG-6000胁迫培养小麦幼苗脯氨酸(Pro)含量的影响
脯氨酸(Pro)是可以与水分子相结合的一种渗透调节物质。在干旱胁迫下，植物中脯氨酸含量的增加可以减少水分的流失降低细胞的渗透势，从而提高植物的抗旱性[13]。图3显示，接入BF3252和加入PEG-6000模拟干旱胁迫培养条件下，小麦幼苗叶片中的Pro含量均高于CK，其中接种BF3252对小麦抗性有一定提高，小麦幼苗培养至14 d时Pro含量最多，高于CK112.93；
在20%PEG-6000和30%PEG-6000胁迫培养条件下及胁迫过程中接种BF3252后培养，小麦幼苗叶片Pro含量明显增加，胁迫培养7 d和14 d时4个试验组Pro含量差异不明显，胁迫培养至21 d时接种BF3252后小麦幼苗叶片Pro含量高于PEG-6000胁迫培养组，说明BF3252对PEG-6000胁迫培养有缓解作用，20%PEG-6000+BF3252、30%PEG-6000+BF3252修复效果分别为10.72%和17.84%。
图3 PEG-6000胁迫培养小麦叶片Pro含量变化
2.5 接种BF3252对PEG-6000胁迫培养小麦幼苗丙二醛(MDA)含量的影响
植物器官在逆境(例如干旱等)下受到伤害，通常发生膜脂的过氧化作用，产生二烯共轭化合物、脂类过氧化合物、丙二醛和乙烯等，其中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一。常用丙二醛(MDA)含量评价植物膜脂过氧化反应程度[14]，在干旱胁迫下，植物丙二醛含量增幅越小，抗旱性越强，反之抗旱性越弱[15]。图4显示，在PEG-6000模拟干旱胁迫培养条件下小麦叶片MDA含量显著增加，20%PEG-6000胁迫条件下对小麦叶片MDA含量相对较高，接入BF3252后小麦叶片种的MDA含量有明显降低，说明20%PEG-6000胁迫条件下接入BF3252(无花果活性内生细菌)及直接接入BF3252对小麦生长有明显的缓解作用，20%PEG-6000+BF3252修复效果表现为：229.73%(7 d)、201.59%(14 d)、106.90%(21 d)，修复效果随培养时间延长而有所减弱；
直接接入BF3252修复效果表现为：51.35%(7 d)、22.22%(14 d)、31.03%(21 d)。PEG-6000浓度达到30%时，小麦叶片MDA含量有增加且随着培养时间延长呈现逐渐降低趋势，接入BF3252后小麦叶片MDA含量高于30%PEG-6000直接胁迫条件下小麦叶片MD，说明高浓度PEG-6000(30%)影响了BF3252的生长，对小麦生长没有缓解作用。
图4 PEG6000胁迫培养小麦叶片丙二醛含量的变化
3.1 无花果活性内生细菌BF3252对PEG-6000胁迫培养小麦生长有一定的缓解作用
李卫芬等[16]发现在模拟干旱条件下的芥菜体内的可溶性糖含量是随PEG-6000渗透胁迫时间的延长而呈明显增加趋势，龚娜等[17]研究结果认为外源内生菌提取物AAC-2可使干旱胁迫下玉米幼苗SS含量增加11.29%。研究[18]表明，随着干旱胁迫的加剧，铃铛刺幼苗体内可溶性蛋白质含量均呈现增加趋势。有研究[19]表明，在干旱胁迫下，玉米幼苗内脯氨酸积累，随着胁迫时间的延长，玉米幼苗脯氨酸含量迅速升高。在盐胁迫条件下，接种内生细菌后，可以提高小麦体内脯氨酸含量，清除细胞内活性氧，维持细胞形态，提高小麦抵抗盐胁迫能力，有利于提高小麦存活率，促进了小麦生长[20]，本试验研究结果也呈现出相同变化趋势。本研究结果发现不同浓度PEG-6000(20%、30%)胁迫培养小麦后导致小麦叶片的SS、Pro、MDA含量增加，说明小麦在干旱逆境条件下，体内会积累各种有机物质和无机物质来保持体内的水分，以适应干旱环境，再接入BF3252后小麦叶片中的SS、Pro、SP的含量有不同程度增加，MDA含量有所降低，无花果活性内生细菌对 PEG-6000模拟干旱胁迫小麦的生长有修复作用，对低浓度PEG-6000(20%)胁迫培养后的小麦修复效果更明显：修复7 d时SS达到最高，分别为31.78%(20%PEG-6000)和13.03%(30%PEG-6000)，SP修复效果为1.47%(20%PEG-6000)和0.97%(30%PEG-6000)，而21 d小麦叶片中的Pro最高，分别为10.72%(20%PEG-6000)和17.84%(30%PEG-6000)；
当PEG-6000浓度为20%时，接入BF3252小麦叶片的MDA降低明显，修复作用分别达到229.73%(7 d)、201.59%(14 d)、106.90%(21 d)。本研究结果表明当PEG-6000浓度为30%时影响了BF3252的生长，SP和MDA含量变化不明显，MDA含量增加。
3.2 无花果活性内生细菌BF3252可促进小麦生长
本研究结果表明，小麦在生长过程中接入BF3252，小麦叶片中的SS、SP、Pro含量增加，而小麦叶片中MDA含量降低，内生细菌与植物协调作用可改善植物生长环境，可促使植物生长及种群建立。内生细菌和植物相互作用，也可协助植物建立植物的内生态恢复系统，从而促进植物根部发育、增加植物营养吸收或改善营养元素利用等手段增强植物利用土壤养分能力[21]，并且能够提高小麦的环境胁迫耐性，从而减轻极端天气对小麦生长产生的危害，促进小麦幼苗的生长。本试验结果表明BF3252对干旱胁迫培养下的小麦幼苗生长有一定的缓解作用。
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