大黄蒽醌类成分在不同煎煮时间内的含量变化分析*
唐艳，张永，潘翔玲，程钢
1 安徽医科大学第一附属医院 安徽合肥 230031
2 国家中医药管理局中药化学三级实验室 安徽合肥 230032
3 安徽省长丰县中医院 安徽合肥 231199
大黄为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatumL.）、唐古特大黄（Rheum tanguticumMaxim. ex Balf.）、药用大黄（Rheum officinale Baill.）的干燥根及根茎，为传统中医药泻下剂中的主要药味，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经等功效[1]。中国药典以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚五种蒽醌类成分为指标性成分，药理研究表明，结合型蒽醌是大黄发挥泻下作用的主要化学成分[2-4]，结合蒽醌在温度过高或受热过久时易分解为游离型蒽醌，故煎煮时间的合理控制对临床大黄入汤剂发挥泻下作用影响较大。目前，已有多篇文献以蒽醌类成分含量为大黄质量控制的检测指标[5-7]，比较不同煎煮时间内不同大黄炮制品对大黄蒽醌类成分的影响，煎煮时间与蒽醌类成分含量的变化的相关实验研究尚未有明确结论。
本研究拟使用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC），以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚五种成分为检测指标性成分，比较在不同煎煮时间内大黄饮片和粗粉的总蒽醌和游离蒽醌的含量变化趋势，以期为临床大黄入汤剂的煎煮时间和煎煮方式提供参考。
1 仪器及试剂
1.1 仪器 Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公 司），超 声 清 洗 器（BiosaferSB-3200DT-6L，南京赛飞生物科技有限公司），电子天平（BT25S，1/100000，赛多利斯科学仪器北京有限公司），电热恒温水浴锅（H.H.S21-4上海医疗器械五厂），调温电热套（PTHW，巩义市予华有限责任公司）。
1.2 药品及试剂 对照品芦荟大黄素（纯度98%，批号B20772）、大黄酸（纯度98%，批号B20245）、大黄素（纯度98%，B20240）、大黄酚（纯度98%，批号B20238）、大黄素甲醚（纯度98%，批号B20242），均购买于上海源叶生物科技有限公司。生大黄饮片购于安徽井泉中药饮片有限公司，经安徽医药高等专科学校方前波副教授鉴定为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根及根茎。三氯甲烷、盐酸、磷酸为分析纯，甲醇（批号17095089，色谱纯，Tediacompaing，Inc）。
2 实验方法
2.1 传统饮片、最粗粉煎煮液的制备 用量筒量取450 ml纯水，至不锈钢量杯中，武火煮沸后，改用文火保持微沸，分别取大黄切制饮片与最粗粉末（全部过一号筛，但混有能通过三号筛的粉末不超过20%）50g，分 别 煎 煮 至5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、40 min时关火取出，煎煮液趁热用纱布过滤，放至室温，转移至500ml容量瓶中，加水稀释摇匀至刻度，即得。
2.2 双颈烧瓶回流提取饮片、最粗粉 用量筒量取500 mL纯水，至1000 mL双颈烧瓶中，电热套中加热回流至水沸腾，改用文火保持微沸，分别取大黄切制饮片与最粗粉末50g加入，继续煎煮，分别在5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min时各取10 mL，每次取完水煎液后立即加入10 mL热水，分别将各时间点样品离心5 min，取上清液，即得。
2.3 溶液的制备
2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取芦荟大黄素1.74mg、大黄酸2.05 mg、大黄素2.00 mg、大黄酚3.60 mg、大黄素甲醚0.84 mg，至25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，超声20 min，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即为混合对照品储备液。
2.3.2 总蒽醌供试品溶液的制备 精密量取大黄水煎液5 mL，至50 mL圆底烧瓶中，加16%的盐酸5 mL，超声2 min，加三氯甲烷10 mL，电热恒温水浴锅中水浴回流1h，放至室温，转移至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中，振摇分层，取三氯甲烷层，上层酸液再用三氯甲烷洗涤两次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，60～70 ℃水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3.3 游离蒽醌供试品的制备 精密量取大黄水煎液2 mL，至10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，超声10 min，加甲醇补足至刻度，即得。
2.4 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 nm×4.6 mm），流 动 相：甲醇-0.1%磷 酸（85：15），检测波长：254 nm，流速：1.0 mL/min，进样量：10μL，柱温：30℃。色谱图见图1，1-5色谱峰分别为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。
图1 对照品溶液（A）及供试品溶液（B）的色谱图
2.5 方法学考察
2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取2.6项下混合对照品储备液0.3 mL，0.5 mL，1mL，2 mL，5 mL，10 mL至10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成不同浓度的对照品溶液，按2.5项下色谱条件进行分析，观察色谱图，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，得到线性回归方程。见表1。
表1 五种蒽醌类成分回归方程和线性范围
2.5.2 精密度试验 吸取同一供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD分别为0.91%、1.23%、0.98%、1.40%、1.37%，均＜3%。
2.5.3 稳定性试验 吸取同一供试品溶液，分别在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，进样，记录峰面积，计算RSD分别为1.25%、1.01%、1.29%、1.70%、1.72%。。
2.5.4 重复性试验 取2.1项下某一煎煮时间的水煎液，按照2.3.3项下供试品的制备方法，平行制备6份游离蒽醌供试品溶液，进样，记录峰面积，带入标准曲线计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量，RSD分别为1.91%、1.33%、1.60%、1.53%、1.82%。
2.5.5 加样回收率试验 精密称取芦荟大黄素1.20 mg、大黄素1.06 mg，至50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，超声20 min，即得储备液A；
精密称取大黄酸3.75 mg，至25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，超声20 min，即得储备液B；
精密称取大黄酚1.01mg、大黄素甲醚1.48 mg，至100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，超声20 min，即得储备液C。取2.3.3项下制备的供试品溶液，离心5min，精密吸取上清液1mL，至10 mL棕色量瓶中，分别精密加入储备液A、B、C各1mL，加甲醇稀释至刻度，超声5 min，用甲醇补足至刻度，2.4项下的色谱条件进行分析，记录峰面积，计算加样回收率分别为100.1%（RSD=1.10%），97.3%（RSD=1.46%），97.6%（RSD=1.70%），7.9%（RSD=1.80%）、101.3%（RSD=1.60）。
2.6 样品含量测定 将总蒽醌和游离蒽醌供试品溶液，在2.4项下的色谱条件进样，得到大黄饮片和粗粉的总蒽醌，游离蒽醌的含量，见表2。
表2 大黄总蒽醌及5个游离蒽醌含量表（n=2）
1 不同提取方法的比较
实验比较了传统煎煮法和双颈烧瓶回流两种提取方法对大黄饮片和粗粉水煎液蒽醌类成分的影响，结果如图2所示，图中AB为饮片提取，CD为粗粉提取，就粗粉提取而言，在不同提取时间点，回流法提取的总蒽醌含量远高于传统煎煮法（图2-A），差异性较为明显，游离蒽醌含量总体也是回流法略高于传统煎煮法（图2-B）。反观饮片提取，总蒽醌含量在前30min，两种提取方法无显著性差异，在40min时，回流法提取率显著提高（图2- C）；
游离蒽醌在5～10min时，传统煎煮法提取率更高（图2-D），之后两种提取方法对游离蒽醌的含量影响较小。此外，传统煎煮方法提取在50-60min时总蒽醌和游离蒽醌成分含量骤减，未达到检测值，而回流法此时两种成分含量未受到影响。
图2 大黄不同提取方法的比较
2 大黄不同煎煮时间内蒽醌类成分的比较
实验比较了以传统煎煮方法提取，大黄饮片和粗粉在不同提取时间内总蒽醌和游离蒽醌的含量变化，结果如图3、图4所示。结果表明，大黄饮片在5～20分钟内，总蒽醌含量随着时间增加不断提高，在20min达到最高值，而游离蒽醌含量在各时间段总体较为稳定，无明显差异；
大黄粗粉在5～15min内总蒽醌和游离蒽醌变化趋势一致，含量均不断降低（图4），15分钟之后二者含量不断增加，但均不超过5分钟时的总含量。
图3 大黄饮片不同提取时间内蒽醌类成分的含量变化图
图4 大黄粗粉不同提取时间内蒽醌类成分的含量变化图
文献报道大黄药材有效成分的含量测定提取过程多是以大黄粉直接提取，比较不同煎煮时间内蒽醌类成分的含量变化[8-9]，本实验基于中药传统“后下”之意，于水煎液微沸之后，再加入大黄饮片，最大程度上还原临床患者在家标准汤剂的煎煮流程，做到在“大黄后下”的基础上再去比较不同煎煮时间内蒽醌类成分含量的高低变化趋势，更具有合理性和现实性。
经过大黄饮片与最粗粉的实验结果对比发现，大黄最粗粉煮散提取较饮片而言，总蒽醌、游离蒽醌含量都明显增高，分析原因为最粗粉和水的接触面积比饮片大，更易于溶解，故在煎煮过程中，粗粉不仅能煎出更多的蒽醌类成分，还能减少煎煮时间，但是大黄粗粉存在临床使用煎煮过程中加盖时大黄容易粘壁，不加盖时容易煮干等问题，并不适用于粉状煎煮，故现临床还是以饮片煎煮入药为主。
传统中医“后下”的释义为药材在煎煮结束之前最后5～10min放入，大黄为后下药材之一，起源于张仲景的大承气汤，本实验结果表明，大黄饮片水煎液结合蒽醌含量在20min时含量最高，与刘永涛[10]等人实验研究数据表明：大黄的泻下成分蒽醌类成分在15～20min达到最大值，结果相互印证；
与传统中药材“后下”时间5～10min相差甚远。生大黄主泻下作用，结合型蒽醌是大黄发挥泻下的主要成分，随着煎煮时间增加，蒽醌含量的变化规律与煎煮时间是否存在相关性存在诸多争议，大黄入标准汤剂的后下时间规律后期需要更加全面的实验研究进一步证实。