介绍一种新型普鲁士蓝与油红O套染的技术方法
陈 菲，李 丽，包春娟
铁死亡是一种与传统细胞凋亡、坏死、自噬不同的新型细胞程序性死亡，其主要机制是在铁离子或酯氧合酶的作用下，催化细胞的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，产生大量的活性氧，从而诱导细胞死亡[1]。其中铁胞内转运与铁蛋白自噬释放铁离子、不饱和脂肪酸聚合和氧化均需利用病理技术手段来鉴定。因此，涉及普鲁士蓝与油红O染色两类特殊染色技术，常规方法是用连续2张组织切片分别染色、观察结果，弊端是无法在1张切片上直观展示两者的相关性。本文首次采用肺铁死亡模型样本进行前固定，冷冻切片后将两种染色套染，最终在1张切片上呈现铁颗粒和脂滴的分布关系，以鉴定造模成功与否，现报道如下。
1.1 材料冷冻组织OCT包埋剂(Thermo NEG50)，一次性刀片(Thermo MX35 ULTRA)，苏木精(Thermo Hematoxylin 7211)，普鲁士蓝染色试剂盒(Solarbio G1422)，油红O染色试剂盒(珠海贝索614041)，针式滤膜过滤器(Millipore 0.22ìm SLGP033RB)，5 mL无菌注射器，4%多聚甲醛，蔗糖溶液，巴氏滴管，吸水纸，缓冲甘油，冷冻切片机(Thermo NX70)，显微镜(Olympus BX51)。
1.2 方法
1.2.1冷冻切片 小鼠肺铁死亡标本10例，戊巴比妥处死后取肺组织，分割成单叶后立即置于4%多聚甲醛中，瓶口处塞入棉球使组织完全浸泡液体于4 ℃冰箱固定24 h、转入15%蔗糖溶液8 h、30%蔗糖溶液24 h脱水处理，待肺叶沉底后，取出放于吸水纸上，吸除多余水分并挤适量冷冻组织OCT包埋剂浸泡15 min(图1)。冷冻托盘加入少量OCT，待凝固后放置肺叶呈椭圆形方向涂胶包埋速冻、制片(图2)。切片厚8 μm，贴于粘附载玻片，自然风干备用。
1.2.2普鲁士蓝与油红O套染 本实验分为两部分染色，均选用商品化试剂盒。(1)新鲜配置亚铁氰化钾和稀盐酸混合液(将A1：Perls stainA与A2：Perls stainB等量混合)，在肺组织切片上滴染1 min，显微镜下控制，用巴氏滴管吸取去离子水充分清洗后，沥水、平铺于湿盒。(2)取油红O染液与水3 ∶1混合，用注射器吸取并接入针式滤膜过滤器上端，匀速推注射器使染液经过滤器从下端流出，均匀滴在切片组织上[2]，30 s后用巴氏滴管从侧面清洗。苏木精复染细胞核1 min，去离子水清洗3次，缓冲甘油封固。
肺组织细胞形态结构清晰，普鲁士蓝与油红O套染显示，铁颗粒呈蓝绿色，脂滴呈红色，细胞核呈蓝色(图3)。铁颗粒与脂滴的分布广泛，两者既有独立区域也有共染区域(图4)，肺铁死亡模型造模成功。
①②③④
随着铁死亡的深入分析，如铁过载导致的神经退行性疾病(阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、帕金森综合征等)、急性肾损伤、心脏缺血性损伤、遗传性血色病、肿瘤的发生与铁死亡失衡亦有关联[3-6]，对于缺血-再灌注损伤模型的建立有重大意义。普鲁士蓝与油红O套染法在同一张切片上可直观了解铁离子与脂质的关系，整个染色操作简便、用时短，对铁颗粒及脂质有良好保护作用，其优势已成为特殊染色中不可或缺的技术手段。
本套染技术难点在于肺组织主要由各级支气管分支及终末的大量肺泡组成含有大量气体的海绵状结构。新鲜肺组织行冷冻切片易形成大面积空洞造成组织丢失；
油红O染色为防止脂滴被破坏仅能使用冷冻切片；
普鲁士蓝染色多为石蜡切片，冷冻切片方法鲜有报道，染色时间需严格把控。因此，将肺组织前固定再行冷冻切片的设计方案，既能有效减少肺部空气，又可保存铁颗粒及脂滴的形态，其可行度高。本科室经多次实验摸索及重复后，已获得稳定及良好的染色效果：(1)4%多聚甲醛较为温和、穿透力较强并能使组织硬化，可有效保护抗原、细微结构及脂类物质，常用于冷冻切片、细胞培养、心脏灌注等；
蔗糖梯度脱水能减少组织中水分的残留[7]。4%多聚甲醛及蔗糖溶液均用0.01 mol/L PBS配制最佳，其具有盐平衡可调整pH值，起缓冲、溶解保护试剂的作用，可有效防止甲醛氧化生成甲酸，使长时间浸泡的铁离子溶解丢失。因此，首选PBS作为溶剂。(2)肺组织较为特殊，固定时切忌漂浮状态。由于肺内含空气体积较轻，易漂浮于固定液表面，放入器皿时用纱布或棉球覆盖，固定液为体积的30～50倍，摇床振荡可促进肺固定[8]；
也可用4%多聚甲醛灌注后再取材固定。(3)肺叶取出时需吸除多余水分，用适量OCT包埋剂浸泡15 min以上，使包埋剂充分渗透到组织内部，填充疏松的肺泡腔，与包埋剂更融合。(4)若组织较小或较薄时，冷冻托盘需加入少量OCT包埋剂垫高，需在常温涂抹后再冷冻，避免温差过大导致组织在切片过程中脱落。包埋剂沿长轴呈椭圆形涂抹使切片受力面积小，减少皱褶产生；
冷冻切片必须使用粘附载玻片，不宜立即水洗，应自然风干30 min以上再操作，可有效防止脱片。(5)普鲁士蓝与油红O染色套染顺序对结果影响较小，本实验先用油红O染色再套染普鲁士蓝，由于使用了针式滤膜过滤器[2]，避免异丙醇分色且整个操作用时短，两者差异无统计学意义。如使用传统油红O染色法建议先染脂滴，防止异丙醇清洗导致普鲁士蓝褪色。(6)普鲁士蓝染液应现配、现用，勿使用金属铁制品容器，清洗切片时以去离子水为宜，防止普通水中含有铁质影响染色结果。染色时间应严格控制，避免过染。(7)区分核固红与油红O的颜色，本实验选用苏木精复染细胞核，染色效果良好。封片使用起保湿作用的缓冲甘油，切忌使用含乙醇或二甲苯的封片剂，导致脂滴溶解。该套染方法已获得研究者认可，顺利完成50余例肺铁死亡模型的染色，建议推广使用。